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dc.creatorStamm, Fernanda Pavani
dc.date.accessioned2013-07-09
dc.date.available2013-07-09
dc.date.issued2013-01-31
dc.identifier.citationSTAMM, Fernanda Pavani. Methodology study for the evaluation of recombinant human parathyroid hormone. 2013. 53 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, 2013.por
dc.identifier.urihttp://repositorio.ufsm.br/handle/1/5945
dc.description.abstractHuman parathyroid hormone (hPTH) is a polypeptide with 84 amino acids and it is the most important peptide regulator for calcium and phosphate ion homeostasis, maintaining bone structure. Recombinant human parathyroid hormone, rhPTH (1-34), produced by DNA technology in Escherichia coli contain the active amino-terminal fragment of the full length hPTH and is currently being used worldwide for the treatment of osteoporosis at high risk of fractures in postmenopausal women and men with osteoporosis primary or hypogonadal. Reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) and size exclusion liquid chromatography (SE-LC) methods were developed and validated for the assessment of recombinant human parathyroid hormone (rhPTH 1-34) in biopharmaceutical formulations. A gradient RP-LC method was carried out on a Zorbax 300 SB C18 column (150 mm x 4.6 mm i.d.), maintained at 40 ºC. The mobile phase A consisted of 0.1 M sodium sulphate buffer, pH 2.3, and the mobile phase B was acetonitrile. The SE-LC method was carried out on a BioSep-SEC-S 2000 column (300 mm x 7.8 mm i.d.), maintained at 25 ºC. The mobile phase consisted of 0.1 M phosphoric acid buffer, pH 2.5, run isocratically at a flow rate of 0.7 mL/min. Cromatographic separation was obtained with retention times of 12.2 min, and 13.2 min, and was linear over the concentration range of 1-250 μg/mL (r 2 = 0.9997) and 2-300 μg/mL (r 2 = 0.9993), respectively, for RP-LC and SE-LC, with photodiode array (PDA) detection at 214 nm. The limits of detection and quantitation were 0.44 and 1.47 μg/mL, respectively, for the RP-LC and 0.79 and 2.63 μg/mL, for the SE-LC. Specificity was established in degradation studies, which also showed that there was no interference of the excipients. Equally, the accuracy was 100.49% and 100.22%, with bias lower than 1.12% and than 0.81%. Moreover, the in vitro cytotoxicity test of related proteins and higher molecular weight forms showed significant differences (p< 0.05) compared to intact molecule. The validated methods were applied for the determination of rhPTH and related proteins in biotechnology-derived products, giving lower mean differences of the estimated content/potencies of 0.64% and 1.31% for the RP-LC and SE-LC related to the in vivo bioassay, and of 0.98% and 0.31% higher, compared to the in vitro cell culture assay, respectively. It is concluded that represents a contribution to establish new alternatives to monitor stability, quality control and thereby assure therapeutic efficacy of the biotechnology-derived medicine.eng
dc.description.sponsorshipCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
dc.formatapplication/pdfpor
dc.languageporpor
dc.publisherUniversidade Federal de Santa Mariapor
dc.rightsAcesso Abertopor
dc.subjectHormônio da paratireóide humano recombinante (1-34)por
dc.subjectCromatografia líquidapor
dc.subjectBioensaiopor
dc.subjectValidaçãopor
dc.subjectCorrelaçãopor
dc.subjectRecombinant human parathyroid hormone (1-34)eng
dc.subjectLiquid chromatographyeng
dc.subjectBioassayeng
dc.subjectValidationeng
dc.subjectCorrelationeng
dc.titleEstudo de metodologias para avaliação do hormônio da paratireóide humano recombinantepor
dc.title.alternativeMethodology study for the evaluation of recombinant human parathyroid hormoneeng
dc.typeDissertaçãopor
dc.description.resumoO hormônio da paratireóide humano (hPTH) é um polipeptídio constituído de 84 aminoácidos e tem função essencial como regulador da homeostase dos íons cálcio e fosfato, e manutenção da estrutura óssea. O hormônio da paratireóide humano recombinante, rhPTH (1-34), é produzido pela tecnologia do DNA em Escherichia coli, apresenta a sequência de aminoácidos responsável pela porção biologicamente ativa do paratormônio natural e é usado clinicamente para o tratamento da osteoporose de alto risco de fraturas em mulheres pósmenopausa e de homens com osteoporose primária ou hipogonadal. No presente trabalho foram desenvolvidos e validados métodos por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) e por exclusão molecular (CL-EM) para a avaliação de rhPTH (1-34) em formulações de produtos biofarmacêuticos. No método por CL-FR, foi utilizada coluna Zorbax 300 SB C18 (150 mm x 4,6 mm d.i.), mantida a 40 ºC. A fase móvel A foi constituída por tampão sulfato de sódio 0,1 M, pH 2,3, e a fase móvel B por acetonitrila, eluídas em gradiente. No método por CL-EM foi utilizada coluna BioSep-SEC-S 2000 (300 mm x 7.8 mm d.i.), mantida a 25 ºC. A fase móvel foi contituída de tampão ácido fosfórico 0,1 M, pH 2,5, eluída em vazão isocrática de 0,7 mL/min. Para ambos os métodos utilizou-se detector de arranjo de diodos (DAD) a 214 nm. A separação cromatográfica foi obtida nos tempos de 12,2 e 13,2 min, sendo linear na faixa de concentração de 1-250 μg/mL (r2 = 0,9997) e 1-300 μg/mL (r2 = 0,9993), respectivamente, para os métodos por CL-FR e CL-EM. Os limites de detecção e quantificação foram 0,44 e 1,47 μg/mL, respectivamente, para o método por CL-FR e 0,79 e 2,63 por CL-EM. A especificidade foi avaliada em estudos de degradação, que também demonstraram que não houve interferência dos excipientes. A exatidão foi 100,49 e 100,22, com bias inferior a 1,12 e 0,81, respectivamente, para os métodos por CL-FR e CL-EM. Além disso, realizou-se o teste de citotoxicidade in vitro das formas degradadas, as quais apresentaram diferença significativa em relação a forma intacta (p<0,05). O métodos propostos foram aplicados para avaliação da potência de rhPTH (1-34) e de proteínas relacionadas em formulações biofarmacêuticas, e os resultados foram comparados com os bioensaios, observando-se diferenças das médias de teor/potência 0,64% e 1,31% inferiores para os métodos por CL-FR e CL-EM, em relação ao bioensaio in vivo, e 0,98% e 0,31% superiores, respectivamente, em relação ao in vitro. Contribuíu-se assim para estabelecer procedimentos que aprimoram o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biotecnológico.por
dc.contributor.advisor1Dalmora, Sergio Luiz
dc.contributor.advisor1Latteshttp://lattes.cnpq.br/4505166045049607por
dc.contributor.referee1Ribela, Maria Teresa de Carvalho Pinto
dc.contributor.referee1Latteshttp://lattes.cnpq.br/5036017643483794por
dc.contributor.referee2Canto, Gizele Scotti do
dc.contributor.referee2Latteshttp://lattes.cnpq.br/2076175621657265por
dc.creator.Latteshttp://lattes.cnpq.br/0964145059273612por
dc.publisher.countryBRpor
dc.publisher.departmentFarmacologiapor
dc.publisher.initialsUFSMpor
dc.publisher.programPrograma de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticaspor
dc.subject.cnpqCNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::FARMACOLOGIApor


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