dc.creator | Xavier, Bruna | |
dc.date.accessioned | 2021-05-12T18:20:51Z | |
dc.date.available | 2021-05-12T18:20:51Z | |
dc.date.issued | 2018-07-24 | |
dc.identifier.uri | http://repositorio.ufsm.br/handle/1/20853 | |
dc.description.abstract | The botulinum toxin type A is one of the seven different serotypes of toxins produced by fermentation process with Clostridium botulinum, under anaerobic conditions. Biotechnological product has been used in therapeutic and cosmetic areas to inhibit the muscle hypercontraction and glandular hypersecretion. In the present study, it was developed and validated a size exclusion liquid chromatography (HPSEC) method to evaluate BoNTA in formulations of biopharmaceutical products. The analyses were performed on a TSKgel® G3000 SWXL column (300 mm x 7.8 mm i.d.) maintained at 25 ºC. The mobile phase consisted of 50 mM potassium phosphate, pH 7.0, run isocratically at a flow rate of 1.0 mL min-1 with photodiode array detection (PDA) set at 220 nm. The chromatographic separation was obtained with retention time of 13.5 min. The calibration curve was linear over the concentration range of 0.29 – 100 U mL-1 (r2 = 0.9998) and the limits of detection and quantitation were 0.08 and 0.29 U mL-1, respectively. The specificity was confirmed by forced degradation studies, interference of the excipients and peaks purity. The mean of accuracy was 100.41%, with bias lower than 0.93. The SE-LC method was applied to assess the content/potency and high-molecular-weight-proteins of BoNTA, and the results were compared with those of the reversed phase liquid chromatography (RP–LC) method previously validated, the T–47D cell culture in vitro bioassay and the mouse LD50 in vivo bioassay, giving mean values of content/potency of 0.87% higher, 0.36% lower and 0.71% higher, respectively. Aggregated forms showed significant decrease of the bioactivity and significant effects on the cytotoxicity (p < 0.05). In this context, the research of alternative methods according to the 3 Rs is emphasized and this study contributes to establish procedures to evaluate the quality, assuring the safety and therapeutic efficacy of biotechnological product. | eng |
dc.description.sponsorship | Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES | por |
dc.language | por | por |
dc.publisher | Universidade Federal de Santa Maria | por |
dc.rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International | * |
dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ | * |
dc.subject | Toxina botulínica tipo A (BoNTA) | por |
dc.subject | Ensaio da DL50 | por |
dc.subject | Cultura de células T–47D | por |
dc.subject | CL-EM (Cromatografia líquida por exclusão molecular) | por |
dc.subject | CL-FR (Cromatografia líquida em fase reversa) | por |
dc.subject | Validação | por |
dc.subject | Botulinum toxin type A (BoNTA) | eng |
dc.subject | LD50 assay | eng |
dc.subject | T–47D cell culture | eng |
dc.subject | SE-LC (Size exclusion liquid chromatography) | eng |
dc.subject | RP–LC (Reversed phase liquid chromatography) | eng |
dc.subject | Validation | eng |
dc.title | Avaliação de potência/teor de toxina botulínica tipo a por métodos cromatográficos e bioensaios | por |
dc.title.alternative | Content/potency assessment of botulinum toxin type a by chromatographic methods and bioassays | eng |
dc.type | Dissertação | por |
dc.description.resumo | A toxina botulínica tipo A (BoNTA) é um dos 7 diferentes sorotipos de toxinas, produzidas através de processo de fermentação com Clostridium botulinum, sob condições anaeróbicas. O produto biotecnológico tem sido utilizado nas áreas terapêutica e cosmética, para inibir a hipercontração muscular e hipersecreção glandular. No presente trabalho foi desenvolvido e validado método por cromatografia líquida por exclusão molecular (CL-EM) para a avaliação de BoNTA em formulações de produtos biofarmacêuticos. Foi utilizada coluna TSKgel® G3000 SWXL (300 mm x 7,8 mm d.i.) mantida a 25 ºC. A fase móvel foi constituída por fosfato de potássio 50 mM, pH 7,0, eluída em vazão isocrática de 1,0 mL min-1 e com detecção por arranjo de diodos (DAD) em 220 nm. O tempo de retenção da BoNTA foi de 13,5 min. A curva de calibração foi linear na faixa de concentração de 0,29 – 100 U mL-1 (r2 = 0,9998) e os limites de detecção e quantificação foram de 0,08 e 0,29 U mL-1, respectivamente. A especificidade foi verificada e confirmada por estudos de degradação forçada, avaliação da interferência dos excipientes da formulação e pureza dos picos. A média da exatidão foi de 100,41%, com erro relativo inferior a 0,93. O método por CL-EM foi aplicado para determinação de teor/potência e das proteínas de alta massa molecular de BoNTA e os resultados foram comparados com os obtidos por cromatografia líquida em fase reversa, previamente validado, com o ensaio por cultura de células T–47D in vitro e o bioensaio da DL50 in vivo observando-se diferenças das médias de teor/potência 0,87% superior, 0,36% inferior e 0,71% superior, respectivamente. As formas agregradas apresentaram redução significativa da atividade biológica e efeitos de citotoxicidade in vitro (p < 0,05). Neste contexto, é infatizada a pesquisa de métodos alternativos de acordo com os 3 Rs e contribuiu-se para estabelecer procedimentos para avaliar a qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biotecnológico. | por |
dc.contributor.advisor1 | Dalmora, Sergio Luiz | |
dc.contributor.advisor1Lattes | http://lattes.cnpq.br/4505166045049607 | por |
dc.contributor.referee1 | Matter, Leticia Beatriz | |
dc.contributor.referee2 | Maldaner, Fernanda Pavani Stamm | |
dc.creator.Lattes | http://lattes.cnpq.br/1761737616973558 | por |
dc.publisher.country | Brasil | por |
dc.publisher.department | Análises Clínicas e Toxicológicas | por |
dc.publisher.initials | UFSM | por |
dc.publisher.program | Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas | por |
dc.subject.cnpq | CNPQ::CIENCIAS DA SAUDE::FARMACIA | por |
dc.publisher.unidade | Centro de Ciências da Saúde | por |