Caracterização de um novo modelo de maturação de oócito in vitro e participação do mTOR na ovulação em bovinos
Abstract
O primeiro estudo caracterizou um modelo in vitro de bloqueio do reinício da meiose de oócitos bovinos. Em um primeiro momento, demonstramos que o uso de um inibidor dos EGFR (AG1478; 5μM) em um sistema de cultivo com metades foliculares (FHS) foi eficiente para manter 89,3% dos oócitos em vesícula germinativa durante 15 h. Esse efeito de bloqueio foi dependente das FHS uma vez que na sua ausência apenas 40% dos oócitos permanecem em vesícula germinativa. O sistema de bloqueio foi totalmente reversível, tendo em vista que os oócitos completaram a maturação após um período adicional de 18 e 20 h, e suportaram o desenvolvimento embrionário subsequente após fertilização in vitro. Quanto ao perfil molecular das células envolvidas no bloqueio, no oócito não foi verificado efeito do tratamento na expressão dos genes avaliados. Entretanto, nas células do cumulus, enquanto a expressão de EGR1, TNFAIP6 e HAS2 foi diminuída pelo tratamento com AG1478, a expressão de CX43 e IMPDH1 foi diminuída pela influência das FHS. Além disso, nas células da granulosa observamos uma diminuição nos níveis de expressão de PGR e ADAMTS1 pelo tratamento com AG1478. Os dados de Western blot nos mostraram que a abundância de p-ERK1/2 diminui em decorrência do tratamento com AG1478 associado as FHS. Posteriormente, verificamos que o efeito inibitório do AG1478 juntamente com as FHS não foi revertido pelo tratamento com AngII ou PGs. Em conclusão, este estudo propõem um modelo efetivo e reversível para o bloqueio do reinício da meiose de oócitos bovinos. Em um segundo estudo, investigamos o papel do sistema mTOR e sua relação com genes regulados pelo LH durante o período pré-ovulatório em bovinos. Utilizando um modelo in vivo, demonstramos que ocorre um aumento na atividade do mTOR em células da granulosa 3 e 6 h após indução da ovulação com GnRH. Em momentos similares (3 h após GnRH) ocorreu maior abundância proteica para p-ERK1/2, STAR e EGR1. Ao injetar rapamicina no ambiente intrafolicular in vivo, não foram observadas alterações nas taxas de ovulação. Entretanto, o uso da rapamicina em cultivo in vitro de células da granulosa inibiu a expressão de RNAm para EREG induzida pelo LH. Além disso, os dados de cultivo comprovaram o efeito da rapamicina em bloquear a atividade do mTOR, caracterizada pela abundância proteica de p-P70S6K, induzir um provável aumento na abundância de p-AKT e não alterar os níveis de p-ERK1/2 e EGR1. Esses resultados fornecem a primeira evidência em bovinos que o sistema mTOR é regulado positivamente pelo LH em momentos similares a p-ERK1/2, STAR e EGR1. Além disso, os dados de inibição do mTOR contribuem para sugerir uma outra rota para a ovulação controlada pela p-AKT, na qual ocorre ativação de ERK1/2 em uma via independente dos níveis de expressão de EREG, AREG e PTGS2.