Otimização e validação da quantificação de malondialdeído plasmático por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção visível
Resumo
A superprodução de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio ou a redução na capacidade antioxidante resulta no estresse oxidativo. A peroxidação lipídica envolve a degradação oxidativa de ácidos graxos polinsaturados e este processo está envolvido na patogênese de doenças como câncer, diabetes, aterosclerose e doenças neurodegenerativas.
Já que a quantificação direta de radicais livres in vivo é complexa, torna-se necessário realizar a medida de seus produtos de reação, e o malondialdeído (MDA) é um dos produtos secundários da peroxidação lipídica mais conhecidos utilizado como indicador de injúria da membrana celular. O MDA tem sido medido através de sua reação com o ácido tiobarbitúrico (TBA), o qual produz o complexo MDA-TBA2, detectado por espectrofotometria método conhecido como substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Porém, o maior problema neste método é a falta de especificidade, uma vez que o TBA reage com uma variedade de compostos, superestimando os valores reais de MDA. Assim, métodos envolvendo cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) têm sido descritos, sendo mais específicos e sensíveis. Neste estudo, um método rápido e confiável para quantificar MDA plasmático por CLAE, com detecção visível, foi otimizado e validado. Os parâmetros analíticos avaliados foram: linearidade, precisão, exatidão, recuperação, sensibilidade, robustez e estabilidade. O método otimizado foi aplicado em pessoas de um asilo da cidade de Santa Maria. As amostras de plasma sofreram hidrólise alcalina com NaOH, para uma liberação completa das proteínas ligadas ao MDA, seguida por desproteinização ácida com H3PO4 e derivatização com TBA. Para remoção de interferentes, realizou-se extração da amostra com n-butanol antes da injeção no cromatógrafo. A análise de MDA foi feita em coluna C18, integrada a uma pré-coluna. A fase móvel constituía de KH2PO4 2,5 mM e metanol (50:50), com eluição isocrática e detecção a 532 nm. A análise foi linear de 0,28 a 6,6 μM. As precisões intra e inter-dia foram obtidas com CV% < 4% a < 11%, respectivamente. A exatidão (bias%) variou de -4,1 a 2% e a recuperação variou de 95,9 a 102,7%. O limite de detecção foi de 0,05 μM e o limite de quantificação foi de 0,17μM. Para os testes de estabilidade, observou-se que as soluções padrões de MDA foram estáveis por, no mínimo, 18 meses a -20ºC. O plasma foi estável por 24h quando estocado a -20ºC e instável 4ºC. Armazenado a -20ºC após hidrólise alcalina, o MDA plasmático não permaneceu estável; por outro lado, as amostras continuaram estáveis por 30 dias quando armazenadas após derivatização com TBA, a -20ºC. Depois da extração com n-butanol, os níveis de MDA foram estáveis por 3 dias armazenados a -20ºC. O método foi aplicado em amostras de plasma de indivíduos saudáveis entre 60 e 80 anos. Os idosos apresentaram níveis plasmáticos de MDA de 4,45 ± 0,81 μM para mulheres e 4,60 ± 0,95μM para homens, sem diferença significativa. Estes valores foram considerados como valores de referência para esta faixa etária em nosso laboratório.
Assim sendo, os resultados demonstraram que uma técnica simples, rápida e específica foi otimizada e validada. O método mostrou ser confiável em todos os parâmetros analíticos, e pode ser usado em rotinas nos laboratórios clínicos.