0 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS ATIVIDADE DA CLOREXIDINA SOBRE BIOFILMES MICROBIANOS DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Pauline Cordenonsi Bonez Santa Maria, RS, Brasil 2014 1 ATIVIDADE DA CLOREXIDINA SOBRE BIOFILMES MICROBIANOS Pauline Cordenonsi Bonez Dissertação de Mestrado apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração em Análises Clínicas e Toxicológicas, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM – RS), como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Profª Drª. Marli Matiko Anraku de Campos Co-orientador: Profº Dr. Roberto Christ Vianna Santos Santa Maria, RS, Brasil 2014 2 ERRATA No Artigo Científico Página: e120 Linha: 68-74 Onde se lê Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, (MRSA) and Pseudomonas aeruginosa were used to study standard strains of Candida albicans (ATCC 90028), E. coli (ATCC 35218), and P. aeruginosa (ATCC 27853), along with clinical isolates of Acinetobacter baumannii, S aureus (ATCC 6538), and MRSA. 8-11 All of these organisms are able to form biofilms, as reported previously. Leia-se In this study, were used standard strains of Candida albicans (ATCC 90028), E. coli (ATCC 35218), S. aureus (ATCC 6538), P. aeruginosa (ATCC 27853) and clinical isolates of Acinetobacter baumannii and meticilin-resistent S. aureus (MRSA). All of these organisms 8-11 are able to form biofilms, as reported previously. 3 Universidade Federal de Santa Maria Centro de Ciências da Saúde Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova a Dissertação de Mestrado ATIVIDADE DA CLOREXIDINA SOBRE BIOFILMES MICROBIANOS elaborada por Pauline Cordenonsi Bonez como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas COMISSÃO EXAMINADORA: Marli Matiko Anraku de Campos, Dra. (UFSM) (Presidente/Orientadora) Roberto Christ Vianna Santos, Dr. (UNIFRA) (Co-orientador) Sandra Trevisan Beck, Dra. (UFSM) Rodrigo de Almeida Vaucher, Dr. (UNIFRA) Santa Maria, 28 de janeiro de 2014. 4 Dedico este trabalho a minha família, em especial a minha mãe Maria Izabel, por não poupar esforços em minha formação acadêmica e por todo amor e carinho a mim dedicados. O meu mais profundo reconhecimento e admiração! Te amo! 5 AGRADECIMENTOS Meu agradecimento a Deus, presença constante em minha vida, pela saúde, esperança, e auxílio na escolha do melhor caminho a seguir. A minha amada mãe, Maria Izabel, pelo amor maior, apoio, doação e exemplo de superação. Obrigada por me guiar, por me mostrar a importância do estudo e por me ajudar a ser quem sou hoje. Ao meu pai Enio (saudades eternas...), pelo legado que nos deixou, pelos valores que prezava, pelo exemplo, pelo amor, pela sabedoria e pela imensa preocupação com o nosso futuro e nossa educação. Te amo! Ao meu querido irmão Mateus, por fazer parte do meu crescimento, pelo amor, pelo apoio, pelo carinho e pela confiança. Te amo, irmão! Ao meu namorado Ronei, pelo amor, pelo carinho, pela amizade e pelo companheirismo. Obrigada por fazer parte da minha vida, dos meus dias....Obrigada pelos momentos felizes, pela compreensão, e também pelos conselhos e puxões de orelha. Te amo muito! Obrigada por tudo! A minha orientadora, professora Marli Matiko Anraku de Campos, pela incansável dedicação, preocupação, respeito, compreensão, competência e amizade. A você, minha admiração e gratidão. Ao meu co-orientador, professor Roberto Christ Vianna Santos, pelo exemplo, por todos os ensinamentos, apoio, incentivo e confiança. A toda minha família, em especial à nona, por sempre rezar por mim. Obrigada tios e primos pela força e confiança depositadas em mim. Amo todos vocês! À família do meu namorado, Dona Rose, Sr. Onei, Leonardo, José Pedro e Greice. Muito obrigada pelo carinho. A todos os meus amigos, principalmente à Laura, à Paula e à Márcia, pelas palavras de incentivo, pela amizade e pelos momentos de descontração. Amo vocês! Aos meus queridos colegas e amigos do Labmyco, Vanessa A., Tanise, Jaciane, Vanessa F., Caren, Grazielle, Bianca e Fallon. Obrigada pelo convívio diário, pela amizade, pela parceria e pela ajuda. Espero sempre encontrar pessoas como vocês em meu caminho. À Camilla, que muito colaborou na realização deste trabalho, obrigada pela amizade e dedicação. 6 Ao meu pequeno amiguinho Shiva, que através de um simples olhar demonstra companheirismo, amor e carinho. A toda a equipe do Laboratório de Microbiologia do Centro Universitário Franciscano (UNIFRA), obrigada pela imensa ajuda e infraestrutura concedida. Aos professores, membros da banca, pela disposição e por avaliarem este trabalho. À Universidade Federal de Santa Maria, ao programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas e ao Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas (DACT). À CAPES e ao CNPq pela bolsa de estudos e pelos recursos financeiros concedidos. A todos aqueles que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste trabalho, e não estão nominalmente citados. Muito obrigada a todos por esta conquista. 7 O resto é o resto... O que resta é o agora e simplesmente o agora. O agora é o sempre e o sempre-eterno é ele. Agora viver, viver o agora... Enio Bonez 8 RESUMO Dissertação de Mestrado Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Universidade Federal de Santa Maria ATIVIDADE DA CLOREXIDINA SOBRE BIOFILMES MICROBIANOS AUTORA: PAULINE CORDENONSI BONEZ ORIENTADORA: MARLI MATIKO ANRAKU DE CAMPOS Data e Local da Defesa: Santa Maria, 28 de janeiro de 2014. Biofilmes são comunidades biológicas com elevado grau de organização, onde os microrganismos se encontram aderidos a uma superfície. Os microrganismos, quando em biofilme, tornam-se alvo de preocupação na área clínica devido à baixa resposta aos tratamentos antimicrobianos e à facilidade de colonização de superfícies como próteses, cateteres e instrumentos cirúrgicos. Vários estudos demonstram que os antimicrobianos e biocidas têm sua eficácia diminuída frente aos biofilmes. A clorexidina é um poderoso antisséptico largamente empregado no ambiente hospitalar, aplicado especialmente na antissepsia de mãos, desinfecção de ambientes cirúrgicos e esterilização de instrumentos utilizados em procedimentos invasivos. Deste modo, o presente trabalho teve como objetivo verificar se biofilmes bacterianos e fúngico são capazes de resistir à atuação antimicrobiana da clorexidina. Testes de disco-difusão e de suscetibilidade foram conduzidos de acordo com CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute), 2013. Para a determinação da CIB (Concentração de Inibição de Biofilme), a clorexidina foi testada nas concentrações da CIM (Concentração Inibitória Mínima) e em concentrações maiores, quando necessário. As placas foram reveladas com solução de 0.1% de Cristal Violeta e a densidade óptica (D.O.) obtida em 570nm. Os resultados demostraram que a clorexidina possui uma excelente atividade antimicrobiana para a maioria dos microrganismos testados em suas formas livres, porém, mostrou-se menos eficaz contra os biofilmes de Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Staphylococcus aureus resistentes a Meticilina (MRSA) e Pseudomonas aeruginosa, desenvolvidos de forma isolada para cada espécie. Assim, sugere-se que a clorexidina apresenta sua atividade antimicrobiana diminuída quando exposta a microrganismos em biofilme. Provavelmente isso ocorra devido aos mecanismos de resistência atribuídos à estrutura do biofilme - matriz exopolissacarídica, quorum sensing (QS), diversidade genética - e também ao uso inadequado deste biocida. Palavras-chave: Biofilmes. Resistência microbiana. Clorexidina. 9 ABSTRACT Master’s Thesis Graduate Program in Pharmaceutical Sciences Universidade Federal de Santa Maria CHLORHEXIDINE ACTIVITY AGAINST BACTERIAL BIOFILMS AUTHOR: PAULINE CORDENONSI BONEZ ADVISER: MARLI MATIKO ANRAKU DE CAMPOS Date and Place of Defense: Santa Maria, January 28, 2014. Biofilms are biological communities with a high degree of organization in which microorganisms are adhered to a surface. Microorganisms, when in biofilm, become a target of concern in the clinical field due to the low response to antimicrobial treatments and ease of colonization of surfaces such as implants, catheters and surgical instruments. Several studies have shown that antimicrobial and biocides have their effectiveness decreased against biofilms. Chlorhexidine is a powerful antiseptic widely used in hospitals especially applied in hand antisepsis, disinfection of environments, and sterilization of surgical instruments used in invasive procedures. Thus, the present study aimed to determine whether bacterial and fungal biofilms are able to resist the antimicrobial action of chlorhexidine. Disk diffusion and susceptibility tests were performed according to Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), 2013. To determine the Biofilm Inhibition Concentration (BIC), chlorhexidine was tested at concentrations of Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and at higher concentrations when necessary. The plates were developed with a solution of 0.1% crystal violet and the optical density (OD) was obtained at 570 nm. Results showed that chlorhexidine has excellent antimicrobial activity against most organisms tested in its free form; however, it was less effective against biofilms of Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Staphylococcus aureus resistant to Methicillin (MRSA) and Pseudomonas aeruginosa, developed in isolation for each species. Thus, chlorhexidine is likely to have its antimicrobial activity decreased when exposed to microorganisms in biofilms. This probably occurs due to resistance mechanisms attributed to the biofilm structure – exopolysaccharide matrix, quorum sensing (QS), genetic diversity – and to the inappropriate use of this biocide. Keywords: Biofilms. Microbial resistance. Chlorhexidine. 10 LISTAS DE ILUSTRAÇÕES Revisão da Literatura Figura 1 - Resumo esquemático das funções associadas ao QS. ............................................ 21 Figura 2 - Esquema dos estágios de desenvolvimento do biofilme microbiano. .................... 25 Figura 3 - Estrutura química da Clorexidina. .......................................................................... 35 Artigo Científico Figura 1 - Densidade óptica das cepas de Acinetobacter baumanii e Pseudomonas aeruginosa em biofilme em relação às diferentes concentrações testadas de clorexidina. ........................ 42 Figura 2 - Densidade óptica das cepas de Staphylococcus aureus e Candida albicans em biofilme em relação à concentração testada de clorexidina. ................................................... 42 Figura 3 - Densidade óptica das cepas de Escherichia coli e MRSA em biofilme em relação às diferentes concentrações testadas de clorexidina. ................................................................... 42 . 11 LISTA DE TABELAS Artigo Científico Tabela 1 - Correlação entre os halos obtidos para cada microrganismo e seus valores da CIM. ..................................................................................................................................... 41 12 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AJIC American Journal of Infection Control API Adesina Plissacarídica Intracelular ATCC Amercian Type Colection Culture CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior c-di-GMP bi-monofosfato de guanosina cíclico dimérico CEP Comitê de Ética em Pesquisa CMIB Concentração Mínima de Inibição de Biofilme CIM Concentração Inibitória Mínima CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico D.O. Densidade Óptica DACT Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas DNA Ácido Desoxiribonucléico IBE Inibidores de Bombas de Efluxo IQS Inibidores de Quorum Sensing IRC Infecções Relacionadas ao Cateter ITU Infecção do Trato Urinário LABMYCO Laboratório de Micobacteriologia MRSA Staphylococcus aureus resistente a Meticilina PCR Reação em Cadeia da Polimerase QS Quorum Sensing RNA Ácido Ribonucléico RS Rio Grande do Sul SPE Substâncias Poliméricas Extracelulares UFSM Universidade Federal de Santa Maria UNIFRA Centro Universitário Franciscano 13 LISTA DE ANEXOS Anexo A - Carta de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) - UFSM. ............. 58 Anexo B - Autorização da revista American Journal of Infection Control (AJIC) para anexação do artigo nesta dissertação. .................................................................................. 61 14 LISTA DE APÊNDICES Apêndice A - Resumos Publicados em Congressos. ........................................................ 67 15 SUMÁRIO 1 APRESENTAÇÃO ........................................................................................................ 16 2 INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 17 3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 19 3.1 Biofilmes: conceito, estrutura e composição .................................................................. 19 3.2 Fatores que influenciam na formação de biofilmes ....................................................... 22 3.3 Etapas da formação do biofilme ...................................................................................... 24 3.4 Participação de biofilmes na resistência antimicrobiana .............................................. 25 3.5 Microrganismos patogênicos e formadores de biofilmes .............................................. 27 3.5.1 Acinetobacter baumanni .................................................................................................. 27 3.5.2 Candida albicans ............................................................................................................. 28 3.5.3 Escherichia coli ............................................................................................................... 29 3.5.4 Pseudomonas aeruginosa ................................................................................................ 29 3.5.5 Staphylococcus aureus e S. aureus resistente à meticilina (MRSA) ............................... 30 3.6 Impacto da formação de biofilmes na área clínica ........................................................ 31 3.7 Estratégias de controle de biofilmes................................................................................ 33 3.8 Clorexidina ........................................................................................................................ 35 4 OBJETIVOS .................................................................................................................... 38 4.1 Objetivo Geral .................................................................................................................... 38 4.2 Objetivos Específicos ......................................................................................................... 38 5 PUBLICAÇÃO CIENTÍFICA .................................................................................. 39 6 CONCLUSÕES .............................................................................................................. 44 7 CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS ............................................ 45 8 REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 47 ANEXOS ............................................................................................................................... 57 APÊNDICES ....................................................................................................................... 66 1 APRESENTAÇÃO O item INTRODUÇÃO consta de uma breve apresentação sobre o assunto investigado e sua relevância. No segmento REVISÃO DA LITERATURA, está descrita uma sucinta revisão bibliográfica sobre os temas trabalhados nesta dissertação. Os resultados que fazem parte desta dissertação estão apresentados sob a forma de artigo, o qual se encontra no item PUBLICAÇÃO CIENTÍFICA. As seções Materiais e Métodos, Resultados, Discussão dos Resultados e Referências, encontram-se no próprio artigo e representam a íntegra deste estudo. Os itens CONCLUSÕES e CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS, encontrados no final desta dissertação, apresentam interpretações e comentários gerais sobre o artigo científico contido neste trabalho, assim como expectativas e sugestões a serem realizadas em estudos futuros. As REFERÊNCIAS remetem somente às citações que aparecem nos itens INTRODUÇÃO e REVISÃO DA LITERATURA desta dissertação. 17 2 INTRODUÇÃO Conceitualmente, o biofilme é o resultado de um complexo ecossistema microbiológico formado por populações desenvolvidas a partir de uma única ou de múltiplas espécies. A microbiota que o compõe pode ser formada por bactérias, fungos e/ou protozoários, de modo isolado ou em combinação. Comumente há a associação dos microrganismos com seus produtos extracelulares, constituindo uma matriz de polímeros orgânicos que se encontra aderida a uma superfície (KASNOWSKI et al., 2010). Estima-se que mais de 90% dos microrganismos são capazes de viver sob a forma de biofilmes e, em tese, praticamente não existe superfície que não possa vir a ser colonizada por microrganismos - seja ela natural ou sintética (COSTERTON et al.,1999; HOIBY et al., 2011). Os biofilmes, além de representar uma fonte potencial de contaminação em indústrias - entupindo tubulações e precipitando a corrosão de equipamentos - têm grande importância para a saúde pública. De acordo com o Ministério da Saúde, cerca de 80% de todas as infecções microbianas em humanos estão relacionadas a biofilmes e, em muitos casos, estão associadas a implantes de dispositivos médicos como cateteres e próteses (HOEFLER et al., 2006; VASCONCELLOS, 2009; MARCINKIEWICZ et al., 2013). A diversidade de microrganismos capazes de formar biofilmes é bastante vasta, incluindo bactérias Gram-positivas, Gram-negativas, fungos filamentosos e leveduras. Dentre os mais reportados, pode-se incluir Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans e Candida parapsilosis (CHEN et al., 2013; AGARWAL et al., 2010). S. aureus e S. epidermidis são frequentemente associados a cateteres cardiovasculares sendo responsáveis por cerca de 40% a 50% das infecções relacionadas ao implante desses dispositivos (AGARWAL et al., 2010). Os cateteres intravasculares estão associados a um risco elevado de infecção, tanto a nível superficial, da pele no local de inserção, quanto à sepse. Abordagens recentes para reduzir o risco de Infecções Relacionadas ao Cateter (IRC) incluem melhoria da antissepsia da pele e uso de cateteres com antimicrobianos (PRATT et al., 2007; CASEY et al., 2008). No entanto, a eficácia de tais medidas é questionável, pois os antissépticos frequentemente utilizados no ambiente hospitalar, além de não erradicarem todos os microrganismos da pele, 18 não os atingindo nas camadas mais profundas, podem, até mesmo, incentivar a formação de biofilmes quando em baixas concentrações (KARPANEN et al., 2009). A dificuldade de tratamento adequado para infecções persistentes, causadas a partir da formação de biofilmes, está diretamente relacionada à estrututra compacta dos mesmos, onde substâncias tóxicas às células microbianas, como por exemplo, os antimicrobianos e antissépticos, enfrentam dificuldades para penetrar no biofilme (VASCONCELLOS, 2009). Diversas pesquisas demonstram que a habilidade de erradicar microrganismos em biofilmes é significativamente menor do que a habilidade de destruí-los na forma planctônica. A resistência das populações microbianas em biofilme aos fármacos e biocidas pode ser de 100 a 1000 vezes maior do que a resistência de populações equivalentes de microrganismos livres (MAKI et al., 1991; DAVIES et al., 1998; DONLAN, 2001). Além disso, microrganismos em biofilme também mostram-se resistentes à fagocitose e a outros mecanismos de imunidade inata do hospedeiro (MARCINKIEWICZ et al., 2013). Neste contexto, é de fundamental interesse científico, que estudos sejam realizados a fim de se conhecer os mecanismos ambientais, moleculares e genéticos envolvidos na formação de biofilmes. Da mesma forma, a avaliação da efetividade de agentes antimicrobianos e biocidas, frente a essas estruturas, se mostra necessária e pertinente, uma vez que a formação de biofilmes está relacionada com problemas terapêuticos graves em humanos. Somente através destes novos conhecimentos será possível estabelecer estratégias capazes de eliminar os biofilmes e/ou impedir sua formação. 19 3 REVISÃO DA LITERATURA 3.1 Biofilmes: conceito, estrutura e composição Os microrganismos são estruturas simples que estão presentes nos mais diversos habitats, porém são capazes de desenvolver comportamentos bastante complexos e variados (COSTERTON et al., 1999). Apresentam-se, tanto na forma planctônica como na forma séssil. Na forma planctônica, os microrganismos encontram-se em suspensão e vivem isoladamente, enquanto que, na forma séssil, se encontram aderidos a superfícies sob a forma de biofilmes (COSTERTON et al., 1995). Os biofilmes podem ser definidos como sendo estruturas funcionais complexas, que apresentam uma variável distribuição de células e agregados, os quais constituem um modo protegido de crescimento, permitindo a sua sobrevivência num ambiente hostil. A vida no interior do biofilme proporciona aos microrganismos um grande número de benefícios quando comparados aos seus homólogos de vida livre. Essas vantagens ocorrem devido ao fato dos agregados de microrganismos apresentarem maior disponibilidade de nutrientes, interferindo nas taxas de crescimento, cooperatividade metabólica e proteção aos fatores externos (DAVIES et al., 1998; BEHLAU & GILMORE, 2008). Biofilmes permitem a coexistência de diferentes microrganismos em sua estrutura, sejam ou não de mesma espécie. São constituídos, não somente por microrganismos, mas também pelas Substâncias Poliméricas Extracelulares (SPE) ou matriz exopolissacarídica e por quaisquer outros resíduos do ambiente colonizado. Biofilmes também são constituídos por proteínas, lipídeos, DNA, RNA, íons e água, formando uma estrutura porosa e altamente hidratada (OLIVEIRA, 2011). A matriz exopolissacarídica é o material extracelular - constituído por diferentes biopolímeros - produzida pelos próprios microrganismos ao qual o biofilme está incorporado. Em média, 90% da massa seca dos biofilmes é contabilizada pelas SPE (GARNETT & MATTHEWS, 2012). As SPE são as responsáveis pela morfologia, estrutura, coesão e integridade funcional dos biofilmes. Do mesmo modo, sua composição determina a maioria das propriedades físico-químicas e biológicas, assim como condiciona a vasta gama de vantagens a este modo de vida (FLEMMING & WINGENDER, 2001; FLEMMING, 2011). 20 A matriz oferece um ambiente protetor às células microbianas, dificultando a penetração de agentes germicidas e agindo como uma barreira de filtragem, gerando uma penetração lenta ou reduzida de agentes antimicrobianos em geral, quer sejam antibióticos ou biocidas. A matriz também protege os microrganismos contra a dessecação, oxidação, radiação ultravioleta e defesa imunitária (FLEMMING, 2011). Esta forma de organização favorece a captação de elementos necessários à sobrevivência, porque a sua estrutura permite a circulação de água, oxigênio e nutrientes. Devido à retenção de enzimas extracelulares, um sistema versátil é gerado, onde os nutrientes são captados e dissolvidos a partir da água existente, permitindo que sejam utilizados como fontes de energia. Assim, os elementos nutritivos presentes nos fluídos circulam e tendem a se depositar neste aglomerado celular (COSTERTON et al., 1999). A arquitetura do biofilme é influenciada por muitos fatores, os quais incluem condições hidrodinâmicas, concentração de nutrientes, motilidade microbiana e comunicação intracelular (FLEMMING, 2011). A matriz exopolissacarídica apresenta papel fundamental no desenvolvimento estrutural do biofilme, e isolar os seus componentes tem sido um desafio em muitas pesquisas. Evidenciou-se, por exemplo, que em estirpes mucóides de P. aeruginosa, o alginato - uma SPE - não é essencial para a formação do biofilme, porém, tem efeito notável sobre a estrutura do biofilme. Cepas mucóides, produtoras de alginato, formaram biofilmes estruturalmente heterogêneos, enquanto que cepas não mucóides desenvolveram estruturas planas e mais homogêneas (TIELEN et al., 2005). Apesar de ser praticamente impossível quantificar toda a matriz constituinte de um biofilme, pode-se estudar a imensa gama de elementos que a compõe, como enzimas, proteínas e lipídeos. Cada componente requer um modo de extração específico - centrifugação, filtração, aquecimento, sonicação, tratamento com agentes de complexação - assim como se supõe terem uma função determinada. Através deste isolamento, pode-se chegar a conclusões ainda mais minuciosas sobre o funcionamento do biofilme (FLEMMING & WINGENDER, 2010). A matriz exopolissacarídica também é responsável por manter as células bem próximas dentro da estrutura do biofilme, permitindo, por conseguinte, fortes interações intercelulares (FLEMMING & WINGENDER, 2010). Este modo de organização é denominado de “quorum sensing” (QS), que pode ser entendido como um “sentido de grupo”. Ou seja, as células, dentro da estrutura do biofilme, se comunicam entre si por meio de moléculas químicas exibindo um modo de vida organizado onde se estabelecem atividades coordenadas (DONLAN, 2001). 21 Esse comportamento só é percebido quando os microrganismos atingem uma determinada densidade populacional limitante, do contrário, se comportam como simples organismos celulares (BHARDWAJ et al., 2013). Microrganismos oportunistas, como P. aeruginosa, expressam o seu fenótipo virulento ao atingirem um determinado tamanho populacional que seja capaz de superar as defesas do hospedeiro (KALIA, 2013). O QS é o exemplo mais bem caracterizado de comunicação química entre os microrganismos, sendo responsável por modular uma variedade de funções celulares, incluindo a formação do biofilme, a patogênese, a aquisição de nutrientes, a motilidade e a produção de metabólitos secundários (RENNER & WEIBEL, 2011). Biofilmes são, portanto, comunidades microbianas espacialmente estruturadas, cuja função depende dessa complexa teia de interações simbióticas (JIANG & LI, 2013). A figura 1 ilustra a gama de funções atribuídas ao QS. Figura 1: Resumo esquemático das funções associadas ao QS (Adaptado de BHARDWAJ et al., 2013). 22 3.2 Fatores que influenciam na formação de biofilmes Múltiplos fatores contribuem para a adesão de um microrganismo à determinada superfície. Dentre eles, incluem-se as características dos microrganismos - como espécie, concentração, produção de SPE, hidrofobicidade, presença de flagelo, fimbria, pili - e as características do material aderente, como porosidade e aspereza, além de elementos como íons, pH, temperatura, pressão e oxigênio (O´TOOLE & KOLTER, 1998; KASNOWSKI et al., 2010; STEWART & COSTERTON, 2001). O tipo de microrganismo envolvido na formação de biofilmes também interfere, uma vez que a sua capacidade de produzir polímeros extracelulares está intimamente relacionada com a adesão às superfícies. Microrganismos com baixa produção de componentes da matriz tendem, por conseguinte, a ter dificuldade no desenvolvimento de biofilmes (MILLEZI, 2012). A hidrofobicidade da superfície dos microrganismos também é um fator que contribui para a sua aderência e colonização de superfícies, sejam inertes ou vivas. Em estirpes de S. aureus, provenientes de cárie dentária, verificou-se que a maioria dos isolados apresentou comportamento hidrofílico, porém, os isolados considerados altamente hidrofóbicos, foram os que demostraram maior capacidade de formar biofilmes em placas de poliestireno (KOUIDHI et al., 2010). A relação entre a motilidade e formação de biofilme tende a ser complexa. A presença de flagelos permite a mobilidade necessária para que o microrganismo alcance uma determinada superfície e também para que estes se movam dentro do biofilme maduro, fazendo com que haja a propagação e crescimento do mesmo. A pili facilita a adesão dos microrganismos e, por conseguinte, a formação do biofilme. Por outro lado, a motilidade também está envolvida na liberação das células microbianas a partir do biofilme maduro, facilitando a sua fragmentação e destruição (VERSTRAETEN et al., 2008). Neste sentido, muitos estudos têm documentado a importância da motilidade na formação do biofilme em vários agentes patogênicos, incluindo P. aeruginosa, Listeria monocytogenes e E. coli (O´TOOLE & KOLTER, 1998; PRATT & KOLTER, 1998; LEE et al., 2013; CHELLAPPA et al., 2013; TODHANAKASEM & YOUNG, 2008). A repressão de genes relacionados com a motilidade de P. aeruginosa é capaz de diminuir a produção de biofilme por esse microrganismo (O´TOOLE & KOLTER, 1998; CHELLAPPA et al., 2013; LEE et al., 2013). Corroborando com estes achados, o mesmo ocorre para estirpes mutantes 23 de E. coli, onde a ausência de motilidade implica em problemas no desenvolvimento do biofilme (PRATT & KOLTER, 1998). Em contrapartida, a perda de flagelos em cepas de L. monocytogenes acarretou em uma maior formação de biofilmes pela diminuição da motilidade (TODHANAKASEM & YOUNG, 2008). Determinadas condições ambientais e nutricionais como variações de pH, temperatura, meio de cultura e adição de íons e minerais, afetam significativamente a formação de biofilmes por alguns microrganismos. Citrobacter werkmanii, por exemplo, tem o seu crescimento planctônico em amplas faixas de pH, porém, a formação de biofilme é maior em valores de pH mais baixos (ZHOU et al., 2013). Dentre os demais microrganismos, contudo, a maioria é capaz de desenvolver biofilme somente em faixas neutras de pH (MACHADO, 2005). Verifica-se, também, que um aumento na concentração de cátions, como sódio, cálcio e íons férrico afeta a fixação de Pseudomonas fluorescens, reduzindo as forças de repulsão entre a célula e a superfície, facilitando a formação de biofilme (KOKARE et al., 2009). Íons, como de ferro e de zinco, foram associados à formação de biofilmes de Mycobacterium tuberculosis. O ferro e zinco são cofatores metálicos de importantes enzimas envolvidas na geração e captura de CO2, bem como na síntese de ácidos micólicos, essenciais na formação e maturação de biofilmes em M. tuberculosis. O oxigênio também representa um elemento importante na formação de biofilmes por M. tuberculosis e, diferentemente da maioria dos microrganismos, o biofilme se desenvolve na interface líquido-ar (OJHA et al., 2008). Condições ambientais como presença de glicose, temperatura e hidrofobicidade modulam, também, a expressão de genes específicos e de segundos mensageiros que desempenham importantes funções sobre a formação de biofilmes (DAVEY & O’TOOLE, 2000). O segundo mensageiro bi-monofosfato de guanosina cíclico dimérico (c-di-GMP) tem sido documentado por ser regulador de uma variedade de processos celulares envolvidos na formação de biofilmes (KIM & PARK, 2013). Esta molécula seria a chave para a transcrição do modo de vida planctônico para a vida em biofilme (SUPPIGER et al., 2013). Informações sobre os mecanismos e funções fisiológicas do c-di-GMP ainda não foram totalmente elucidadas, porém, trabalhos recentes abordaram a importância desta molécula na biologia do biofilme onde relataram que níveis elevados de c-di-GMP intracelular promovem uma maior formação de biofilme para microrganismos como Bordetella bronchiseptica e P. aeruginosa (SISTI et al., 2013; KIM & PARK, 2013). A formação de biofilme parece estar intimamente relacionada com a expressão de bombas de efluxo em alguns microrganismos. Trata-se de um mecanismo de resistência que 24 pode ser encontrado em bactérias e fungos, o qual permite que o ambiente interno das células microbianas seja regulado através da remoção de substâncias tóxicas, incluindo agentes antimicrobianos e moléculas sinalizadoras do QS (OLIVARES et al., 2013; SOTO, 2013). Em estirpes do complexo Burkholderia (Burkholderia pseudomallei), por exemplo, a formação de biofilme demonstrou ser dependente de bombas de efluxo do tipo BpeAB - Opr-B (CHAN & CHUA, 2005). As bombas de efluxo são, portanto, altamente ativas em biofilmes, tornando-se um alvo atraente para medidas anti-biofilme (BAUGH et al., 2012). 3.3 Etapas da formação do biofilme O processo de formação do biofilme inicia-se com a adesão microbiana e a posterior maturação do biofilme. A fase de adesão inicial é caracterizada pela aproximação do microrganismo à superfície (CARPENTIER & CERF, 2003). Nesta etapa, há a participação de estruturas de adesão (fímbrias e flagelos) presentes na superfície celular. A motilidade flagelar é necessária para levar a célula bacteriana até a superfície superando as forças de repulsão, facilitando a adesão (O´TOOLE & KOLTER, 1998). À medida que os nutrientes se acumulam, as células pioneiras se reproduzem originando microcolônias. Na ausência de interferência mecânica ou química, a adesão torna- se, nesta fase, irreversível. As microcolônias também sintetizam substâncias extracelulares e passam a atuar como substrato para a aderência de microrganismos denominados colonizadores secundários, que podem se aderir diretamente aos primários ou promoverem a formação de co-agregados com outros microrganismos, e então se aderirem aos primários (DONLAN, 2001). Posterior à adesão irreversível do microrganismo à superfície, inicia-se o processo de maturação do biofilme. A consolidação do biofilme maduro acontece, principalmente, pelo aumento da densidade populacional e deposição de componentes extracelulares gerados pelos microrganismos. O biofilme maduro caracteriza-se por ser uma estrutura altamente hidratada e viscoelástica, constituindo-se de um aspecto gelatinoso e escorregadio (DONLAN, 2001; WATNICK & KOLTER, 2000). Por fim, quando o biofilme atinge uma etapa de amadurecimento, a massa microbiana é liberada e os microrganismos desprendidos poderão colonizar novos ambientes e se 25 tornarem fontes de contaminação (GARNETT & MATTHEWS, 2012). As etapas de desenvolvimento do biofilme podem ser visualizadas na figura 2. Figura 2: Esquema para o modelo mais aceito dos estágios de desenvolvimento do biofilme microbiano. (1) Microrganismos planctônicos. (2) Adesão reversível a uma superfície. (3) Os microrganismos começam a se dividir e a formar microcolônias. (4) As colônias crescem e secretam uma mistura complexa de hidratos de carbono, proteínas e lípidos. (5) Biofilme totalmente maduro com arquitetura complexa. (6) Desestruturação do biofilme e dispersão das células que darão início a novos biofilmes (Adaptado de GARNETT & MATTHEWS, 2012). 3.4 Participação de biofilmes na resistência antimicrobiana No biofilme, os microrganismos desenvolvem várias relações de cooperação, de forma sinérgica ou inibitória, que influenciam na patogenia e na saúde do paciente (PIVA, et al., 2011). Bactérias ou fungos em biofilme apresentam maior resistência aos fármacos antimicrobianos e desinfetantes, causando infecções que persistem apesar do tratamento. O inóculo necessário para a manifestação da infecção é cerca de 100 vezes menor quando este forma superfícies de biofilme. Do mesmo modo, a Concentração Inibitória Mínima (CIM) para microrganismos em biofilme podem ser de até 1000 vezes maior do que para microrganismos planctônicos (DAVIES et al., 1998; DONLAN, 2001). Múltiplos mecanismos, atuando conjuntamente, podem explicar a resistência de biofilmes frente a antimicrobianos e biocidas. As substâncias poliméricas que o constituem induzem a resistência física retardando a difusão dos antimicrobianos e desinfetantes, impedindo a penetração destes nas camadas mais profundas. Além disso, os microrganismos 26 poderiam se diferenciar em fenótipos mais resistentes ou a depleção de nutrientes e acúmulo de resíduos poderia antagonizar os efeitos dos antimicrobianos (STEWART & COSTERTON, 2001). O comportamento multicelular da vida em biofilme é um dos principais mecanismos moduladores da resistência aos fármacos e biocidas (KALIA, 2013). A influência do QS sobre a virulência de alguns microrganismos quando em biofilme como Burkholderia cepacia, P. aeruginosa e Staphylococcus sp. são somente alguns exemplos de patógenos que têm sua tolerância aos antimicrobianos associada a este complexo sistema (SUPIGGER et al., 2013; DENG et al., 2013; KONG et al., 2013). Outro fator responsável pela resistência a antimicrobianos em estruturas de biofilmes é a expressão de bombas de efluxo por alguns microrganismos (SOTO, 2013). O seu exato papel sobre a resistência de biofilmes não está totalmente esclarecido. Supõe-se que este mecanismo possa influenciar na regulação exercida pelo QS e, por conseguinte, acarretar em alterações na biologia do biofilme. O sistema de efluxo seria necessário para que as moléculas se difundissem através da membrana celular, aumentando a sinalização e, consequentemente, a expressão de genes de resistência. Ao mesmo tempo, pode estar relacionado com a extrusão dessas moléculas (SOTO, 2013). Em P. aeruginosa, a resistência atribuída aos biofilmes é mediada por alguns genes reguladores, entretanto, o mecanismo pelo qual agem é pouco elucidado. Evidenciou-se, que um desses genes reguladores - o brlR - atua ativando bombas de efluxo neste microrganismo e, por isso, há tolerância dos biofilmes aos antimicrobianos (LIAO et al., 2013). Ainda neste sentido, também em biofilme de P. aeruginosa, foi demonstrado que a supressão de genes que codificam seu sistema de efluxo ocasiona um aumento na sensibilidade de alguns antimicrobianos (ZHANG & MAH, 2008). Os microrganismos podem tornar-se resistentes aos antimicrobianos por mutação espontânea ou através de aquisição de informação genética de outros microrganismos através da troca de plasmídeos por conjugação no interior do biofilme (DAVEY & O’TOOLE, 2000). A conjugação (mecanismo de transferência de plasmídeos) ocorre numa taxa maior entre as células em biofilmes do que entre as planctônicas, pois há uma maior proximidade física entre as células, favorecendo a passagem dos plasmídeos. Essa transferência horizontal de genes é importante para a evolução e diversidade genética das comunidades microbianas. Os microrganismos no interior de um biofilme expressam diferentes características quando comparadas com seus homólogos de vida livre. Isso se deve, justamente, à transcrição de 27 genes durante a vida planctônica e às diferentes fases do ciclo de vida em um biofilme (DONLAN, 2001; COSTERTON et al.,1999). Instiga-se, também, que muitos microrganismos possam adquirir resistência a antissépticos e desinfetantes por adaptar-se a uma variedade de condições ambientais. (MURTOUGH et al., 2001). A teoria de adaptação a biocidas foi comprovada pela atividade de concentrações subinibtórias de Cloreto de Benzalcônio, que mantiveram ativos ou selecionaram microrganismos adaptados ao ambiente natural. A concentração do biocida e a natureza limitante em nutrientes poderiam, portanto, desempenhar um papel significativo no resultado do processo de seleção de microrganismos multirresistentes (MC CAY et al., 2010). Deste modo, além dos conhecidos mecanismos envolvidos na resistência de biofilmes a antimicrobianos - matriz exopolissacarídea, sinalização célula-célula, diversidade genética - pode-se sugerir que o uso contínuo e inadequado dos desinfetantes pode estar relacionado aos maiores índices de resistência. 3.5 Microrganismos patogênicos e formadores de biofilmes Praticamente todos os microrganismos são capazes de formar biofilmes em determinadas condições. Várias espécies bacterianas e fúngicas têm sido estudadas no sentido de elucidar os mecanismos envolvidos na formação e resistência dos biofilmes (COSTERTON et al., 1999). Dentre os microrganismos altamente patogênicos incluem-se também os potencialmente formadores de biofilme que assumem papel importante na capacidade de causar infecções graves e persistentes em humanos (HOIBY et al., 2011). 3.5.1 Acinetobacter baumanni Bactérias do gênero Acinetobacter sp. são importantes patógenos nosocomiais, os quais contribuem significativamente com a morbidade e mortalidade de pacientes internados (WROBLEWSKA et al., 2008). Durante muito tempo, Acinetobacter sp. foi considerado um agente oportunista de baixa patogenicidade. No entanto, têm sido reportados um grande número de surtos de infecções hospitalares envolvendo Acinetobacter sp. multirresistentes em 28 diversas partes do mundo (D’AREZZO et al., 2009). Infecções adquiridas em ambiente hospitalar por Acinetobacter sp. envolvem, principalmente, o trato respiratório, trato urinário e feridas, podendo progredir para sepse (SILVA, 2009). A. baumannii, especialmente, possui capacidade de sobreviver na maioria das superfícies ambientais. A habilidade deste patógeno de formar biofilme pode explicar sua proeminente resistência aos antimicrobianos e as consequentes propriedades de sobrevivência (WROBLEWSKA et al., 2008; BIERHALS, 2012). Isolados clínicos de A. baumanni provenientes de amostras biológicas como feridas, ossos e sangue foram altamente formadores de biofilme segundo publicação recente. Das 53 estirpes isoladas de A. baumannii, 29 foram capazes de formar biofilme (SANCHEZ et al., 2013). A formação de biofilme em instrumentos médico-hospitalares fornece um nicho favorável à formação de biofilme por A. baumanni, a partir dos quais este microrganismo pode colonizar pacientes e dar origem a infecções graves. Igualmente, o A. baumanni demostrou ser capaz de sobreviver em condições de dessecamento e à desinfecção, tornando- se, desta forma, fonte de preocupação na área clínica e científica (BIERHALS, 2012). 3.5.2 Candida albicans Espécies do gênero Candida correspondem a cerca de 80% das infecções fúngicas de origem hospitalar e são a quarta causa de infecções sanguíneas, conduzindo a óbito em 25 a 38% dos pacientes que desenvolvem candidemia. Neste contexto, C. albicans é considerado o patógeno mais comumente isolado em pacientes com fungemia (SWINDELL, 2009). C. albicans é um microrganismo comensal, estando presente no ser humano sem causar infecções, coexistindo com o hospedeiro. Pode colonizar o trato intestinal, oral, vaginal, respiratório, urinário e sanguíneo. Contudo, em pacientes imunocomprometidos, esta levedura pode causar sérias infecções nas mucosas, que incluem candidíases vaginais e infecções orais ou sistêmicas (CARDOSO, 2004). Entre as espécies fúngicas, é o microrganismo mais comumente associado à formação de biofilmes. Os biofilmes de C. albicans estão associados a implantes de materiais invasivos como stents, próteses, tubos endotraqueais e representam, juntamente com outros fungos, a terceira causa de infecções associadas à cateteres (RAMAGE et al., 2005). O desenvolvimento de biofilme por este microrganismo tem repercussões clínicas sérias, uma 29 vez que alguns antifúngicos convencionais não são efetivos, sendo altamente resistentes a uma ampla gama de agentes antifúngicos (TOBUDIC et al., 2012). 3.5.3 Escherichia coli E. coli é uma bactéria anaeróbia facultativa Gram-negativa que faz parte da microbiota normal do homem e de animais. Entretanto, em condições de imunossupressão, essa espécie pode causar infecções e levar à doença no trato intestinal ocorrendo, em alguns casos, disseminação e colonização para o sistema nervoso central, o trato urinário e o sangue (MILLEZI, 2012). Atualmente é responsável por mais de 80% de todas as infecções do trato urinário (ITU) e está frequentemente relacionada com a implantação de dispositivos médicos (OLIVEIRA, 2011). Provavelmente, a aderência bacteriana esteja, também, relacionada com o processo de infecção deste microrganismo (HANCOCK et al., 2007). Diversos estudos relatam a formação de biofilmes em linhagens de E. coli patogênicas nas mais variadas superfícies, que vão desde polipropileno até objetos invasivos (MILLEZI, 2012). Alguns fatores, como a presença de fímbrias, contribuem para a adesão e o crescimento deste microrganismo em biofilme (EMODY et al., 2003). Recentemente, contatou-se que cepas de E. coli tornaram-se tolerantes a alguns biocidas - como hipoclorito de sódio - ao serem expostas a concentrações sub-inibitórias destes produtos. Por consequência, essas cepas apresentaram menor suscetibilidade a uma gama de antimicrobianos e maior capacidade de formação de biofilme (CAPITA et al., 2013). 3.5.4 Pseudomonas aeruginosa A família de bactérias mais pesquisada, em termos de adesão a superfícies, pertence à Pseudomonadaceae, sendo P. aeruginosa o microrganismo mais explorado. É um patógeno oportunista conhecido por causar infecções do trato urinário e do sistema respiratório, assim como dermatites, infecções dos tecidos moles, bacteremia e uma variedade de infecções sistêmicas, principalmente em pacientes imunocomprometidos (BERNARDO, 2009). Atualmente, se posiciona entre as principais bactérias causadoras de infecções hospitalares, 30 afetando mais de dois milhões de pacientes todos os anos, sendo responsável por cerca de 90.000 mortes (FIGUEIREDO et al., 2007; MULCAHY et al., 2013). Muitas dessas infecções estão associadas ao implante de dispositivos médicos - como cateteres, tubos e sondas. O desenvolvimento de biofilmes nesses materiais está estreitamente relacionado com a dificuldade terapêutica encontrada nestes casos. Os biofilmes de P. aeruginosa são tolerantes a uma série de antimicrobianos e biocidas sob uma variedade de condições de crescimento, sendo os isolados clínicos multirresistentes, os de maior habilidade em desenvolver biofilmes (MULCAHY et al., 2013). Foi demonstrado que P. aeruginosa tem habilidade para formar biofilmes em uma série de superfícies, incluindo tecidos vivos como os pulmões, feridas e queimaduras (O’TOOLE & KOLTER, 1998). A formação de biofilmes por este microrganismo, em pacientes com fibrose cística, por exemplo, pode causar complicações sérias e até a morte, uma vez que a antibioticoterapia se torna altamente ineficaz frente à fixação dos biofilmes no tecido pulmonar (SINGH et al., 2000). Superfícies de alumínio, encontradas em aparelhos odontológicos, também demonstraram ser um nicho altamente propício à formação de biofilme por este microrganismo (FREITAS et al., 2010). Do mesmo modo, P. aeruginosa é capaz de formar biofilmes em lentes de contato, podendo ocasionar um sério risco de contaminação e dano ocular (DUTTA et al., 2012). 3.5.5 Staphylococcus aureus e S. aureus resistente à meticilina (MRSA) O S. aureus é considerado um patógeno humano oportunista e frequentemente está associado a infecções adquiridas na comunidade e no ambiente hospitalar. No individuo sadio, o S. aureus é usualmente comensal das fossas nasais, pele e até intestino. As infecções resultam, portanto, da introdução dessas bactérias em locais previamente estéreis após um trauma, abrasões de pele e mucosas ou durante procedimentos cirúrgicos (MENEGOTTO & PICOLI, 2007). Infecções comuns envolvem a pele (celulite, impetigo) e feridas em sítios diversos, porém, episódios mais graves, como bacteremia, pneumonia, osteomielite, endocardite, miocardite, pericardite e meningite, também podem ocorrer (ZAVADINACK et al., 2001; OTTO, 2008). 31 Este microrganismo foi capaz de desenvolver rapidamente resistência aos antimicrobianos. Já na década de 60, foi constatada a resistência à meticilina, a qual era a alternativa terapêutica lançada para cepas resistentes à penicilina. Neste período então, passaram a ser identificados os denominados S. aureus resistentes à meticilina (MRSA) (MENEGOTTO & PICOLI, 2007). O gênero Staphylococcus em geral - incluindo S. aureus e MRSA - são reconhecidos como causas frequentes de infecções associadas à formação de biofilmes. Por isso, os dispositivos precisam ser retirados com frequência dos pacientes infectados (OTTO, 2008). Muitos aspectos fisiológicos e moleculares, envolvidos na formação de biofilmes de S. aureus e MRSA, vêm sendo amplamente estudados (OTTO, 2008). Estes microrganismos têm extraordinária capacidade de fixação em dispositivos médicos de longa permanência e isso ocorre devido interação direta com a superfície do polímero ou através do estabelecimento de conexões com proteínas da matriz (PERIASAMY et al., 2012). A formação de biofilme em S. aureus é mediada pela produção de API (Adesina Polissacarídea Intracelular) e pela expressão de diversas proteínas. A expressão da API requer algumas condições ambientais específicas de cultivo, como por exemplo, a presença de glicose, anaerobiose, alta osmolaridade e temperatura, assim como limitação de etanol e ferro. Além disso, os genes que codificam a API - produtos do lócus ica - demonstraram ser fundamentais para a formação e virulência dos biofilmes formados por estas estirpes (ARCHER et al., 2011). Isolados clínicos de S. aureus provenientes de cárie bucal apresentaram os genes icaA e icaD em 50% de todas as estirpes estudadas por KOUIDHI et al. (2010). Em outro trabalho, estirpes de MRSA, isoladas de pacientes internados em unidade intensiva de tratamento, exibiram, em 68,3%, habilidade em formar biofilmes. Do total de 86 isolados formadores de biofilmes, 100% expressaram o gene icaD e 96,5%, o gene icaA (CHA et al., 2013). 3.6 Impacto da formação de biofilmes na área clínica Os biofilmes têm grande importância tanto para a produtividade industrial quanto para a saúde pública (ZHANG, 2012). Constitui uma das principais justificativas para a dificuldade de tratamento de endocardites, já que podem se formar biofilmes nas superfícies de válvulas naturais ou protéticas. Neste contexto, a maioria das infecções causadas por biofilmes está 32 associada à utilização de implantes médicos invasivos (cateteres intravenosos e urinários, próteses ortopédicas, mamárias, etc.). Atualmente, um grande número de cateteres é inserido em pacientes, e destes mais de 60% acabam relacionados com a formação de biofilmes. Nestes casos, o período de hospitalização pode aumentar de 2 a 3 dias, exacerbando em 1 bilhão de dólares, todos os anos, os custos associados ao manejo destes pacientes (DAVEY & O’TOOLE, 2000). As infecções associadas com a formação de biofilme em cateteres causam a morte de cerca de 10.000 pacientes, e despesas hospitalares de US$ 11 bilhões por ano nos Estados Unidos (FINE, 2005). Estima-se que a formação de biofilme ocorre em 20% dos cateteres urinários inseridos em pacientes, acarretando em dificuldades na terapêutica. Além disso, embora menos estabelecido, o biofilme pode estar relacionado a doenças sem associação com implantes, como a fibrose cística. Esta condição se apresenta intimamente relacionada com os microrganismos formadores de biofilme (DAVEY & O’TOOLE, 2000). Os hospitais utilizam uma grande quantidade de desinfetantes para eliminar microrganismos tanto da pele humana como de superfícies inanimadas (NUÑEZ & MORETTON, 2007). Muitos agentes oportunistas pela capacidade formação de biofilmes estão relacionados a infecções hospitalares. Biofilmes de S. epidermidis mostraram-se resistentes aos efeitos de isopropanol, etanol, metanol, peróxido de hidrogênio e cloreto de benzalcônio, sugerindo que alguns biocidas utilizados atualmente no ambiente hospitalar, quando em baixas concentrações, não conseguem controlar este reservatório de infecção hospitalar (CHAIEB et al., 2010). O aumento da resistência dos biofilmes aos desinfetantes tem dificultado a sua erradicação nos ambientes hospitalares. A falta de sucesso na eliminação desses biofilmes vem se tornando um fator preponderante em surtos de infecções e doenças, devido a problemas de contaminação. Os processos de desinfecção e esterilização, assim como outras técnicas antissépticas, constituem procedimentos importantes para o controle e prevenção de infecções hospitalares e necessitam, por conseguinte, de uma avaliação criteriosa de suas atividades antimicrobianas a fim de comprovar a sua eficiência (SILVA, 2009). 33 3.7 Estratégias de controle de biofilmes Os antimicrobianos convencionais - devido ao seu uso indiscriminado e à estrutura complexa dos biofilmes - na maioria das vezes, não são efetivos contra biofilmes. Deste modo, muitas estratégias alternativas têm sido estudadas e utilizadas para prevenir a adesão microbiana, retardar a formação de biofilmes e eliminar ou pelo menos reduzir a sua acumulação. Atualmente, tem aumentado a busca de táticas efetivas contra os biofilmes, principalmente no que diz respeito à obtenção de novos produtos que possuam alta atividade antimicrobiana (MARCINKIEWICZ et al., 2013; MARTINEZ-GUTIERREZ et al., 2013). Essas abordagens incluem a utilização de moléculas de baixo peso molecular capazes de atuarem como Inibidores do QS (IQS), nanopartículas, revestimentos anti-biofilme, combinação de antimicrobianos, utilização de produtos naturais, inibidores de bombas de efluxo, entre outras. As moléculas e enzimas têm sido investigadas para inibir ou interromper a formação de biofilmes; os revestimentos têm sido alvo com o propósito de modificar e/ou revestir superfícies de dispositivos médicos a fim de dificultar a adesão microbiana (MARCINKIEWICZ et al., 2013). A descoberta de compostos capazes de inibir a ação de moléculas sinalizadoras de QS parece ser uma estratégia promissora para controlar a formação e virulência dos biofilmes. Diversos IQS já foram descritos e patenteados, os quais incluem, por exemplo, furanonas, triclosan, extrato de alho, macrolídeos e ciprofloxacino (KALIA, 2013; MARCINKIEWICZ et al., 2013). Estes compostos interferem na sinalização célula-célula, provocando, consequentemente, a inibição de biofilmes (MARCINKIEWICZ et al., 2013). Ainda neste contexto, nos últimos 15 anos, muito se têm explorado sobre a relação entre Inibidores de Bombas de Efluxo (IBE) e a formação de biofilmes (KOURTESI et al., 2013). Algumas publicações têm comprovado que os IBEs são potenciais agentes capazes de inibir a formação de biofilmes, assim como os IQS. A atuação de inibidores de bomba sobre biofilme de Salmonella typhimurium, E. coli, K. pneumoniae, S. aureus e Pseudomonas. putida evidenciaram diminuição e, até mesmo, erradicação das películas formadas (KVIST et al., 2008; BAUGH et al., 2012). Da mesma forma, o verapamil - conhecido IBE - desempenhou excelente atividade anti-biofilme de C. albicans. Neste mesmo estudo, o verapamil, quando em combinação com fluconazol e tunicamicina, demostrou efeitos sinérgicos contra o biofilme (YU et al., 2013). 34 Nos últimos anos, a aplicação de nanopartículas se expandiu consideravelmente (MARTINEZ-GUTIERREZ et al., 2013). A utilização desta tecnologia para aperfeiçoar a atividade de compostos frente a biofilmes também tem sido relatada. Nanopartículas de prata demostraram, recentemente, excelente eficácia na prevenção da formação dessas películas e na erradicação de biofilmes já estabelecidos por estirpes de A. baumanni, P aeruginosa, C. albicans, MRSA e Streptococcus mutans. Nanopartículas de hexametafosfato de clorexidina também foram ativas contra MRSA e P. aeruginosa, tanto na forma planctônica quanto em biofilme (BARBOUR et al., 2013). Logo, sugere-se que este artifício venha a ser considerado na prevenção e tratamento de infecções relacionadas aos biofilmes (MARTINEZ- GUTIERREZ et al., 2013). Os produtos naturais são fonte de compostos biologicamente ativos, muitos dos quais, têm sido a base para o desenvolvimento de novos fármacos (PALOMBO, 2011). Neste sentido, alguns inibidores de biofilmes têm sido isolados a partir de plantas medicinais, o que é bastante vantajoso, pois estes são, em geral, menos tóxicos e mais específicos do que os compostos sintéticos. A alga marinha Delisea pulchra produz furanonas halogenadas capazes de inibir o QS e, consequentemente, protege-la da colonização microbiana. O extrato de alho tem atividade semelhante à furanona e reduz a formação de biofilme por P. aeruginosa pela inibição do QS. O extrato de gengibre também demonstrou ser efetivo contra biofilme de P. aeruginosa (KIM & PARK, 2013). Compostos - como o sulfatiazol - capazes de interferir na produção de c-di-GMP ou facilitar a degradação desta molécula constituem outra categoria de inibidores de biofilme, uma vez que este é um segundo mensageiro que modula este estilo de vida. Em adição, a dispersina e óxido nítrico, capazes de promoverem a dispersão das células do biofilme, e enzimas que degradam o DNA, também foram documentados como opção terapêutica para a eliminação de biofilmes (KIM & PARK, 2013). A utilização de bacteriófagos - vírus específicos que infectam bactérias - pode ser um tratamento promissor contra os biofilmes. Os bacteriófagos poderiam atuar na degradação de exopolissacarídeos da matriz extracelular que compõe o biofilme e, assim, destruí-los (SHARMA et al., 2013). Recentemente, foi confirmado que o bacteriófago K foi capaz de reduzir significativamente a colonização bacteriana e a presença de biofilme formado em cateter venoso central por S. aureus (LUNGREN et al., 2013). Ademais, processos físicos como a terapia fotodinâmica também tem sido utilizada. Trata-se de lasers de baixa potência que combatem os microrganismos tratados com drogas fotossintetizantes (SHARMA et al., 2013). Em estirpes de C. albicans, Candida glabrata e 35 Staphylococcus mutans a utilização desta terapia mostrou-se bastante promissora, uma vez que reduziu significativamente a atividade metabólica do biofilme quando comparado ao grupo controle (QUISHIDA et al., 2013). As vantagens deste mecanismo incluem a não evidência de resistência bacteriana e a opção de combiná-lo com nanopartículas a fim de potencializar o efeito antimicrobiano (SHARMA et al., 2013). 3.8 Clorexidina A clorexidina é representada pela fórmula molecular de C22H30Cl2N10, com massa molecular de 505,4 g/mol (PUBCHEM, 2013). Quimicamente é classificada como Digluconato de Clorexidina. É uma molécula estável, que quando ingerida é excretada pelas vias normais, sendo que a pequena porcentagem retida no organismo não é tóxica. Quando em baixas concentrações provoca lixiviação de substâncias de pequeno peso molecular, como o potássio e o fósforo, exercendo efeito bacteriostático e bactericida em altas concentrações (BAMBACE et al., 2003). A clorexidina é composta estruturalmente por dois anéis clorofenólicos nas extremidades, ligados a um grupamento biguanida de cada lado, conectados por uma cadeia central de hexametileno, como pode ser visualizado na figura 3. Esta biguanida catiônica é uma base forte, mais estável na forma de sal, sendo praticamente insolúvel em água. Os sais originalmente produzidos foram o acetato de clorexidina e o cloridrato de clorexidina, mas devido a sua baixa solubilidade em água foram substituídos, com o passar do tempo, pelo sal atualmente usado, o digluconato de clorexidina (VITALIS, 2012). 36 Figura 3: Estrutura química da Clorexidina (PUBCHEM, 2013). As soluções aquosas de clorexidina são mais estáveis em valores de pH de 5 a 8. Acima deste valor, ocorre precipitação da clorexidina, enquanto que em pH ácido, há redução da sua atividade, devido à perda da estabilidade da solução. Em pH fisiológico, exerce excelente atividade antimicrobiana, proporcionada pela liberação das moléculas de carga positiva (PARSONS et al., 1980; RINGEL et al., 1982). O efeito antimicrobiano da clorexidina se dá pela atração e adsorção das moléculas catiônicas da clorexidina à superfície celular dos microrganismos. Esta interação promove a alteração da permeabilidade da membrana celular, resultando na perda dos componentes intracelulares e no desequilíbrio osmótico da célula. A quantidade de fármaco absorvida é proporcional à saída dos constituintes celulares. Em pH neutro, é rapidamente adsorvida à superfície celular dos microrganismos, fazendo com que a concentração de moléculas livres de clorexidina na solução seja baixa (VITALIS, 2012; CLOREXIDINA, 2013). Atualmente, o digluconato de clorexidina é amplamente utilizado como desinfetante hospitalar e odontológico. É utilizado como colutório bucal e em tratamento das infecções gengivais e em cirurgias odontológicas. Na área médica atenta-se para o seu uso em assepsia pré-operatória, assepsia do campo operatório e em instrumentos cirúrgicos. (CLOREXIDINA, 2013). A clorexidina vem sendo alvo de muitas pesquisas as quais tentam demonstrar sua atividade antimicrobiana frente às cepas bacterianas e fúngicas que tenham relevância clínica e principalmente àquelas que são capazes de formar biofilmes. Um estudo realizado por Shen et al., (2011), o qual teve como objetivo avaliar a atividade antimicrobiana da clorexidina 37 frente a bactérias em biofilme em diferentes fases de desenvolvimento constatou haver, sim, uma maior resistência dos microrganismos testados frente ao desinfetante. Pôde-se observar também que a taxa de resistência aumentava tanto quanto mais maduro fosse o biofilme bacteriano. Em equipamentos para ventilação mecânica, tanto a clorexidina quanto peróxido de hidrogênio ou hipoclorito de sódio, apresentam menos efeito sobre a microbiota residente em biofilme que sobre bactérias planctônicas (PEETERS et al., 2008). A clorexidina não seria capaz, também, de erradicar biofilmes bacterianos formados em placas dentárias (DORNELLES-MORGENTAL et al., 2011). Em adição, demostrou capacidade de interromper a formação de biofilme formado por Porphyromonas gingivalis, porém, foi incapaz de destruir o biofilme (YAMAGUCHI et al., 2013). A clorexidina também tem sido explorada em estudos que pretendem inibir o desprendimento do biofilme e a consequente formação dessas películas em outros locais, evitando assim, outros focos de infecção. O desprendimento de biofilmes de S. mutans foi diminuído pela clorexidina, porém, somente em concentrações superiores à CIM (Concentração Inibitória Mínima). Utilizando a CIM, a clorexidina promoveu o desprendimento do biofilme formado por este microrganismo (LIU et al., 2012). Para resolver o problema da presença de microrganismos no ponto de inserção de cateteres, formulações de clorexidina em gel têm sido associadas a esses dispositivos, demonstrando alta atividade durante até sete dias dessa apresentação, reduzindo assim o risco de infecção (KARPANEN et al., 2011). Da mesma forma, essas formulações parecem exercer boa atividade contra biofilmes dentais, porém, pastas contendo metronidazol, minociclina e ciprofloxacina apresentaram-se mais efetivas nestes casos (ORDINOLA-ZAPATA et al., 2013). Neste contexto, vernizes de clorexidina com liberação sustentada também têm sido especulados. Essa formulação apresentou excelente atividade antibiofilme contra P. aeruginosa, Entercoccus sp. e E. coli isolados de cateter urinário e stents uretrais, respectivamente (SHAPUR et al., 2012; ZELICHENKO et al., 2013). Todavia, mais estudos são necessários antes que esta abordagem seja implementada na prática clínica (ZELICHENKO et al., 2013). 38 4 OBJETIVOS 4.1 Objetivo Geral Avaliar a atividade da clorexidina sobre biofilmes microbianos. 4.2 Objetivos Específicos 4.2.1 Verificar, através de disco-difusão, a atividade antimicrobiana da clorexidina frente aos microrganismos testados; 4.2.2 Determinar as Concentrações Inibitórias Mínimas (CIMs) da clorexidina frente aos microrganismos; 4.2.3 Avaliar a capacidade de formação de biofilme de cada microrganismo de acordo com ensaio semi-quantitativo em placas; 4.2.4 Determinar a Concentração Mínima de Inibição de Biofilme (CMIB); 39 5 PUBLICAÇÃO CIENTÍFICA Os resultados que fazem parte desta dissertação estão apresentados sob a forma de artigo científico, o qual se encontra aqui organizado. Os itens Materiais e Métodos, Resultados, Discussão dos Resultados e Referências, encontram-se no próprio artigo. O artigo está disposto na forma como foi publicado na revista American Journal of Infection Control. American Journal of Infection Control (ISSN 0196-6553, Qualis B1, Fator de Impacto 2.731) (Dezembro/2013, vol. 41, nº 12) 40 41 42 43 44 6 CONCLUSÕES A partir dos objetivos e resultados deste estudo, pode-se concluir que:  No ensaio de disco-difusão, a clorexidina mostrou-se efetiva contra todos os microrganismos testados em suas formas planctônicas;  Através da técnica de microdiluição em caldo, a clorexidina foi capaz de inibir o crescimento dos microrganismos em concentrações ideais, evidenciando a eficácia e o alto rendimento deste composto;  Como previamente relatado na literatura, todos os microrganismos estudados foram capazes de formar biofilme quando submetidos à técnica semi-quantitativa;  A formação de biofilme de C. albicans e S. aureus não altera a suscetibilidade destes microrganismos frente à ação da clorexidina;  A. baumannii e P. aeruginosa, em biofilme, apresentaram maior resistência à clorexidina quando comparados às formas livres. Novos testes - com concentrações menores do composto - seriam necessários para determinar a concentração mínima capaz de destruir o biofilme formado por esses microrganismos;  A clorexidina, nas concentrações testadas, não foi efetiva para inibir o crescimento microbiano de E. coli e MRSA. 45 7 CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS A habilidade em desenvolver biofilmes está intimamente associada com a capacidade do microrganismo de causar infecções e, como tal, deve ser motivo de preocupação na comunidade científica. A compreensão de fatores genéticos e fisiológicos, associados à formação de biofilmes, contribui para a elucidação do potencial patogênico apresentada por estes microrganismos. A presente dissertação concentrou-se no estudo da eficácia da clorexidina sobre biofilmes formados por estirpes causadoras de infecções graves e de grande relevância clínica. Pôde-se comprovar, através dos experimentos, que alguns dos microrganismos testados, quando em estrutura de biofilme, apresentaram, de fato, um comportamento diferente no que diz respeito à capacidade de resistir aos agentes biocidas. Entretanto, ainda que os objetivos deste trabalho tenham sido alcançados, muitas questões não ficaram bem esclarecidas e outras surgiram. Este trabalho proporcionou apenas um entendimento preliminar sobre a biologia do biofilme, tornando-se, desta forma, imprescindível que estudos complementares sejam realizados, visando a um melhor entendimento sobre os mecanismos envolvidos na formação de biofilmes e na resistência a antimicrobianos atribuída a estas complexas estruturas. Assim sugere-se, a curto e a longo prazo:  Incorporar aos estudos de formação de biofilmes uma cepa padrão capaz de desenvolver estas películas, a fim de tornar os resultados ainda mais fidedignos, como por exemplo a P. aeruginosa PAO1;  Expandir o estudo a outros biocidas e agentes antimicrobianos;  Testar os biocidas em concentrações mais diversas - maiores ou menores - com a finalidade de obter as concentrações exatas capazes de destruir o biofilme;  Caracterizar fenotipicamente os biofilmes através de testes de hidrofobicidade, autoagregação e coagregação a células;  Avaliar a motilidade microbiana através de testes de motilidade e produção de slime; 46  Identificar e avaliar as condições ambientais ideias de formação de biofilmes, como temperatura, pH, tempo de incubação e concentração de nutrientes;  Quantificar os níveis de proteínas e SPE nos biofilmes formados;  Avaliar a formação de biofilme em diferentes tipos de materiais;  Analisar opticamente o biofilme - através da Microscopia Confocal e/ou Força Atômica - a fim de obter informações 3D da estrutura do biofilme;  Pesquisar e avaliar, por PCR, a expressão de genes correlacionados com a formação e resistência de biofilmes;  Sequenciar o produto de PCR das estirpes que apresentarem ou não estes genes, correlacionando as mutações verificadas com o padrão fenotípico de produção de biofilme;  Pesquisar a presença de sistemas de efluxo - através de métodos fenotípicos e genotípicos - e correlacionar com a formação e resistência de biofilme;  Avaliar a formação de biofilmes após a inibição das bombas de efluxo com Inibidores de Bomba de Efluxo (IBE);  Verificar a suscetibilidade de isolados clínicos provenientes de materiais invasivos - como cateteres, por exemplo;  Testar novas estratégias de controle de biofilmes baseada na combinação de antimicrobianos e biocidas.  Determinar e comparar a influência do estresse oxidativo na formação de biofilmes entre estirpes resistentes e sensíveis aos fármacos testados;  Avaliar a eficácia dos antimicrobianos e biocidas - frente aos biofilmes - na forma de fármaco livre e nanopartículas. 47 8 REFERÊNCIAS AGARWAL, A.; SINGH K. 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III Congresso Latino Americano de Resistência Microbiana e X Sul Encontro de Controle de Infecção, 8 a 11 de maio de 2013, Gramado-RS. SIQUEIRA, F. S.; FLORES, V. C.; BONEZ, P.C.; ROSSI, G. G.; MIZDAL, C.R.; DALMOLIN, T.V.; BIANCHINI, B.V.; ALVES, C.F.S.; CAMPOS, M.M.A; SANTOS, R.C.V. Atividade da Clorexidina sobre biofilme de Staphylococcus aureus. III Congresso Latino Americano de Resistência Microbiana e X Sul Encontro de Controle de Infecção, 8 a 11 de maio de 2013, Gramado-RS. BIANCHINI, B.V.; DALMOLIN, T.V.; SIQUEIRA, F. S.; ROSSI, G. G.; FLORES, V. C.; BONEZ, P.C.; MIZDAL, C.R.; ALVES, C.F.S.; CAMPOS, M.M.A.; SANTOS, R.C.V. Efetividade da Clorexidina sobre biofilme de Pseudomonas aeruginosa. III Congresso Latino Americano de Resistência Microbiana e X Sul Encontro de Controle de Infecção, 8 a 11 de maio de 2013, Gramado-RS. MARQUES, J.B.; BONEZ, P.C.; AGERTT, V.A.; FLORES, V. C.; BIANCHINI, B.V.; MIZDAL, C.R.; CAMPOS, M.M.A.; SANTOS, R.C.V. Atividade da clorexidina sobre biofilme de Acinetobacter baumannii. XXI Congresso Latinoamericano de Microbiologia, 28 de outubro a 1º de novembro de 2012, Santos-SP. CAMPOS, M.M.A.; BONEZ, P.C.; FLORES, V. C.; AGERTT, V.A.; MARQUES, J.B.; BIANCHINI, B.V.; DALMOLIN, T.V.; SANTOS, R.C.V. Atividade da clorexidina sobre biofilme de Candida albicans. XXI Congresso Latinoamericano de Microbiologia, 28 de outubro a 1º de novembro de 2012, Santos-SP.