Análise filogenética de amostras de vírus da raiva de herbívoros no Rio Grande do Sul (2012-2017) e validação de um teste de RT-PCR em tempo real para diagnóstico
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Data
2020-02-20Primeiro membro da banca
Flores, Eduardo Furtado
Segundo membro da banca
Cargnelutti, Juliana Felipetto
Terceiro membro da banca
Roehe, Paulo Michel
Quarto membro da banca
Santos, Diego Viali dos
Metadata
Mostrar registro completoResumo
O vírus da raiva (Rabies lyssavirus, RABV) é o agente da raiva, uma doença zoonótica de distribuição mundial, caracterizada por sinais neurológicos graves, de curso geralmente fatal, que afeta mamíferos domésticos e selvagens. O RABV pertence à ordem Mononegavirales, família Rhabdoviridae, gênero Lyssavirus. O genoma do RABV consiste de uma molécula de RNA de fita simples de sentido negativo, com aproximadamente 12 quilobases (kb) e contém 5 genes, entre eles o gene da nucleoproteína (N) que é altamente conservado e tem sido amplamente utilizado como alvo de estudos filogenéticos, assim como no desenvolvimento de testes de diagnóstico. No primeiro estudo que compõe esta Tese, descreve-se uma análise filogenética de 145 amostras de RABV oriundas de herbívoros no Rio Grande do Sul (RS), entre 2012 e 2017, baseada na análise da sequência parcial do gene da proteína N. Estas sequências exibiram uma alta identidade de nucleotídeos (nt) e similaridade de aminoácidos (aa) entre si, bem como com sequências de RABV identificadas em bovinos e de morcegos hematófagos. Os vírus segregaram em dois clusters distintos. O cluster 1 agrupou sequências de RABV abrangendo todo o período estudado, enquanto o cluster 2 agrupou um número menor de vírus detectados em 2013, 2014, 2015 e 2017. Em alguns casos, vírus obtidos de uma mesma região em um curto período de tempo agruparam em clusters ou sub-clusters distintos, indicando a co-circulação de vírus de diferentes linhagens. A separação em sub-clusters também foi observada em sequências virais obtidas de uma mesma região em diferentes momentos, indicando o envolvimento de mais de um vírus. O segundo estudo reporta o desenvolvimento e validação de um ensaio em tempo real, baseado em transcrição reversa seguida de reação da polimerase em cadeia (RT-PCR em tempo real; RT-qPCR) para o diagnóstico da raiva em bovinos. Os primers foram desenhados visando a região altamente conservada do gene da proteína N a partir de sequências de RABV de bovinos do RS obtidas do GenBank. O limite de detecção correspondeu a 12,99 cópias de DNA e a repetibilidade intra- e inter-ensaio foi adequada. Não foram detectadas amplificações inespecíficas com outros patógenos de síndromes neurológicas semelhantes à raiva em bovinos no RS, nem contaminação cruzada. Amostras de cérebro bovino de 21 casos suspeitos de raiva foram testadas com o novo ensaio e com o teste padrão-ouro de imunofluorescência direta (FA). A sensibilidade e a especificidade da RT-qPCR foram determinadas. A sensibilidade e a especificidade diagnóstica foram ambas 100%. Em resumo, os estudos apresentados na presente Tese revelaram uma alta conservação do gene da proteína N e a circulação de duas linhagens e sub-linhagens diferentes de RABV no RS, confirmando a adequação do gene N no estudo das relações genéticas entre amostras de RABV. Além disso, a RT-qPCR se apresentou sensível e específica nos critérios analítico e diagnóstico. Em função disso, o ensaio aqui proposto se mostrou útil para diagnóstico da raiva em bovinos, apresentando rapidez, sensibilidade e especificidade adequadas.
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