Caracterização enzimática da e-ntpdase em linfócitos residentes de orgãos imunes primários, secundários e não imunes de ratos wistar
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Data
2021-09-03Primeiro coorientador
Leal, Daniela Bitencourt Rosa
Primeiro membro da banca
Battastini, Ana Maria Oliveira
Segundo membro da banca
Rosemberg, Denis Broock
Terceiro membro da banca
Jaques, Jeandre Augusto dos Santos
Quinto membro da banca
Pillat, Micheli Mainardi
Metadata
Mostrar registro completoResumo
Ectoenzimas apresentam uma importante função no controle da sinalização desenvolvida por nucleotídeos e nucleosídeos de adenina em inúmeras células. Entretanto, pouca informação sobre as características bioquímicas das ectoenzimas que hidrolisam ATP e ADP extracelular em linfócitos é encontrada na literatura científica. Sendo assim, neste projeto pretendeu-se realizar a caracterização enzimática das ectoenzimas presentes nos linfócitos residentes da medula óssea, sangue, timo, linfonodos cervicais e mesentéricos, baço e fígado. Em um primeiro experimento realizamos a padronização da técnica de isolamento de linfócitos teciduais. No segundo experimento realizamos a caracterização enzimática da atividade ectonucleotidásica presente nas células em estudo. Os resultados encontrados demonstraram que as técnicas para o isolamento de linfócitos residentes apresentaram alta pureza em linfócitos e boa viabilidade, imprescindível para a análise de ectoenzimas. Para todas as amostras testadas, a atividade enzimática apresentou linearidade conforme aumento da concentração de proteínas e tempo de reação. A hidrólise enzimática ocorreu em uma temperatura ideal de 37ºC e em um meio de reação contendo um valor de pH 8.0. O plot de Chevillard confirmou que a hidrólise de ATP e ADP ocorrem no mesmo sítio ativo da enzima. Confirmamos a necessidade dos cátions divalentes Ca2+ e Mg2+, os quais apresentaram dose-resposta até a concentração de 0.5mM, entrando em um platô nos valores de atividade enzimática após tal concentração. Todos estes resultados são característicos da ectoenzima E-NTPDase, mas para confirmar sua ação majoritária nas células em estudos realizamos a análise de inibidores de ATDPases. Refutamos a ação de outras enzimas capazes de hidrolisar nucleotídeos extracelulares, uma vez que os inibidores de tais enzimas não foram capazes de inibir a hidrólise de ATP e ADP nas amostras em análise. Por outro lado, os compostos EDTA (agente quelante dos cofatores), suramina (inibidor não específico da E-NTPDase), azida de sódio a 20 mM (capaz de inibir a atividade da E-NTPDase) e POM-1 (inibidor da E-NTPDase e E-NPP-1) foram capazes de inibir a hidrólise enzimática. É importante ressaltar que refutamos a ação da E-NPP-1 em nossas amostras uma vez que houve atividade na presença de Ca2+ o qual não é cofator desta ectoenzima e ao adicionar Zn2+ (cofator da E-NPP-1) não houve atividade enzimática. Ao realizar os gráficos de cinética enzimática encontramos diferentes valores de Vmax e km entre os isolamentos de linfócitos. Onde os valores de Vmax em ordem decrescente para os linfócitos isolados de cada órgão foram: fígado, baço, linfonodos mesentéricos, medula óssea, sangue, linfonodos cervicais e timo para ambos os nucleotídeos. Por fim, é possível concluir que a hidrólise de ATP e ADP na membrana plasmática de linfócitos residentes dos órgãos imunes primários (medula óssea e timo), secundários (baço e linfonodos) e não imunes (sangue e fígado) ocorre preferencialmente pela E-NTPDase. A partir da caracterização enzimática realizada neste estudo determinamos um valor padrão de atividade da E-NTPDase para cada linfócito residente. Estes valores padronizados são importantes para futuros estudos que visem analisar a atividade desta ectoenzima como um marcador da atividade linfocitária em processos patológicos. Além disso, sinaliza os possíveis diferentes efeitos de agentes moduladores da E-NTPDase nos linfócitos de cada tecido.
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