Injeção intracitoplasmática de espermatozoide: métodos de ativação oocitária e desestabilização da membrana espermática
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2017-02-09Metadatos
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O desenvolvimento de embriões bovinos produzidos por injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) é baixo em relação aos embriões fertilizados. Deficiência na ativação de oócitos, capacitação inadequada de espermatozóides e falta de descondensação de espermatozóides são os principais transtornos que afetam o sucesso de ICSI em bovinos. No presente trabalho, foram testados métodos de ativação com o intuito de estabelecer um protocolo efetivo para a ativação de oócitos bovinos após a ICSI. Para isso, um inibidor específico de CDK1 (RO-3306) e um ativador específico de PKC (OAG) foram utilizados após a incubação com Ionomicina (ION) para avaliar a retomada da meiose em oócitos bovinos. Além disso, a incubação em meio Fert durante 6 h e a eletroporação (El) de espermatozoides previamente a ICSI foram testadas para verificar o efeito sobre a descondensação do espermatozoide e formação do pró-núcleo (PN) masculino. Inicialmente oócitos bovinos foram incubados, com diferentes concentrações e períodos de exposição aos tratamentos. Foram avaliados conforme a taxa de ativação oocitária (formação de PN), clivagem, desenvolvimento a blastocisto e número de células nos embriões que se desenvolveram a blastocisto. As taxas de PN foram maiores (P≤0,01) nos grupos ativados com ION+RO (48,5 %) e ION+RO+OAG (65,6 %) comparado com ION (12,3 %) e ION+OAG (9,2 %). Não houve efeito significativo entre as concentrações 5,0, 7,5 e 10,0 μM de RO sobre a taxa de ativação. A taxa de ativação foi significativamente maior (P≤0,01) em oócitos tratados com RO por 240 min (84,6 %) comparado a 60 (53,6 %) e 120 min (60,0%). No entanto, não houve diferença significativa na taxa de ativação quando o tratamento com RO foi iniciado a 0, 30 ou 60 minutos após a incubação com ION. A taxa de clivagem foi inferior nos grupos ION (11,8 %) e ION+OAG (22,8 %) comparada aos grupos ION+RO (70,2 %) e ION+RO+OAG (62,4 %). A taxa de blastocistos também foi maior no grupo ION+RO+OAG (24,1 %), mas não houve diferença estatística entre os grupos ION+RO (19,7 %) e ION+OAG (9,5 %). Não houve desenvolvimento a blastocisto quando os oócitos foram tratados somente com ION. Não foi detectada diferença estatística entre os tratamentos sobre o número médio de células por blastocistos. No segundo experimento, espermatozoides não tratados (ICSI-Cont) ou tratados por electroporação (ICSI-El) foram microinjetados em oócitos, os quais foram ativados com ION+RO por 240 min e fixados cerca de 15 h após a injeção para determinar a taxa de formação de PNs masculino e feminino (2PN). A maioria dos oócitos apresentaram o PN feminino bem desenvolvido (66,4 %). A formação de 2PN (masculino e feminino) foi maior no grupo ICSI-El (33,3 %) comparado ao grupo ICSI-Cont (9,4 %). Em conclusão, esse estudo demonstrou que a inibição específica da CDK1 após o tratamento com ION promove a ativação de oócitos bovinos. O tratamento de espermatozoides com eletroporação melhora a formação do PN masculino após ICSI, mas a taxa é inferior a formação do PN feminino. Esses resultados indicam que a deficiente descondensação do espermatozoide é o principal limitante para estabelecer um protocolo eficaz para ICSI em bovinos.
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