Isolamento de DNA genômico em amostras foliares de Nectandra megapotamica (Spreng.) Mez. (Lauraceae)
Resumo
Nectandra megapotamica (Spreng.) Mez é uma espécie florestal nativa de importância ecológica e farmacológica, devido ao seu grande potencial de produção de fármacos. A seleção de indivíduos geneticamente superiores é uma alternativa viável para alavancar os estudos referentes a esse potencial. No entanto, por se tratar de uma espécie que produz grandes quantidades de metabólitos secundários, o isolamento de DNA genômico em quantidades suficientes e de boa qualidade, é um passo crucial para o desenvolvimento de qualquer técnica de análise direta do ácido desoxirribonucleico. Considerando o exposto, o objetivo geral do presente estudo foi definir um protocolo de extração de DNA, específico para Nectandra megapotamica (Spreng.) Mez., capaz de obter amostras de qualidade e quantidade para aplicações posteriores. Foram testadas amostras foliares secas à temperatura ambiente, secas em estufa à 40 °C e secas em forno micro-ondas, além de quatro protocolos de extração de DNA (Dellaporta, Ferreira e Grattapaglia, Khanuja e Mazza e Bittencourt). Foram avaliadas as razões A260/A230, A260/A280, a concentração de DNA obtida, a integridade do DNA, a funcionalidade do DNA via digestão pela enzima Hind III e a correlação entre a curva de absorvância esperada para uma amostra de DNA e a curva observada. Para os tipos de amostras foliares, foi verificado que é possível extrair DNA dos três tipos de amostras foliares. Porém, apenas as amostras secas em temperatura ambiente apresentaram resultados para qualidade e quantidade dentro do esperado. Na análise dos diferentes protocolos de extração, Mazza e Bittencourt e Ferreira e Grattapaglia apresentaram os melhores resultados para concentração de DNA. No entanto, esses exibiram elevados teores de contaminação, verificado pelo aspecto gelatinoso e coloração castanha ao final do procedimento, comprovando o indicado pelos resultados das razões. A análise da correlação da curva de absorvância para esses dois protocolos, revelou que os picos de absorvância foram em 220 nm e 245 nm, respectivamente, indicando altos teores compostos fenólicos ou polissacarídeos nas amostras. O protocolo Dellaporta apresentou os melhores resultados para as duas razões, uma concentração de DNA intermediária, a maior correlação entre a curva de DNA esperada e a observada, além do DNA extraído ter sido digerido pela enzima Hind III, o que não foi verificado para os demais protocolos. Com o intuito de otimizar o protocolo Dellaporta, foram realizados testes com diferentes concentrações de SDS (10, 15, 20 e 25%), PVP (0, 1, 2 e 3%), Acetato de Potássio (2,5; 5; 7,5 e 10 M) e NaCl no tampão de eluição (0; 0,5; 1 e 1,5 M), em que foram avaliadas a concentração de DNA, a razão A260/A280 e A230/A230 e correlação entre as curvas de absorvância. Os testes com NaCl no tampão de eluição e Acetato de Potássio, não resultaram ganhos significativos, indicando os seus respectivos usos conforme o protocolo original. Para SDS, as concentrações de 15 e 25% extraíram a maior quantidade de DNA. Porém, 15% apresentou uma razão A260/A230 abaixo do esperado. Com relação ao PVP, a ausência e a presença na concentração de 1% apresentaram resultados muito próximos, porém, o último apresentou uma maior correlação entre as curvas de absorvância. A análise conjunta de todas as variáveis, indica que o uso de SDS 25% e PVP 1% no protocolo Dellaporta, contribuiram para melhorar a concentração e a qualidade do DNA isolado.
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