dc.creator | Pedroso, Natália Hettwer | |
dc.date.accessioned | 2023-03-09T10:40:30Z | |
dc.date.available | 2023-03-09T10:40:30Z | |
dc.date.issued | 2023-02-07 | |
dc.identifier.uri | http://repositorio.ufsm.br/handle/1/28122 | |
dc.description.abstract | Neonatal calf diarrhea (NCD) is a complex disease that affects calves, especially in the first
month of life, and is responsible for high economic losses, being a major health challenge in
beef and dairy cattle herds. NCD has a multifactorial etiology and is often frequently
associated with single or mixed viral, bacterial and protozoal infections. Consequently,
laboratory diagnostic of NCD usually requires specific tests for each agent, a time-consuming,
laborious, complex and expensive process. Herein, we describe an end-point multiplex
PCR/RT-PCR (one-step RT-PCR-based) for individual or simultaneous detection of five
major NCD agents: bovine rotavirus (BRV), bovine coronavirus (BCoV), Escherichia coli
K99 (E. coli K99), Salmonella enterica (S. enterica) and Cryptosporidium parvum (C.
parvum). Initially, we selected and/or designed high-coverage primers. Subsequently, we
standardized the multiplex PCR/RT-PCR, optimizing the mix (primer concentration and
enzyme volume) and assay conditions (initial denaturation, annealing and extension
temperature, and number of cycles). After careful and rigorous optimization, we evaluated the
analytical sensitivity of the multiplex for the five targets and then assessed the assay's
diagnostic performance by testing 95 clinical samples of diarrheaic calf feces. The analytical
specificity was evaluated against other bovine pathogens: bovine viral diarrhea virus
(BVDV), E. coli heat-stable enterotoxin (STa) and Eimeria spp. The detection limit of our
multiplex was 10 infectious units of BRV, 10-2 dilution of a BCoV positive sample pool, 5 x
10-4 CFU for S. enterica, 5 x 10-6 CFU for E. coli K99 and 50 oocysts for C. parvum. No nonspecific
amplification of other potential bovine diarrhea agents was detected in the assay. Out
of 95 samples analyzed, 50 (52.6%) were positive for at least one target, being 35 and 15
single and mixed infections, respectively. BRV was the most frequent agent detected in single
infections (16/35), followed by Cryptosporidium spp. (11/35), which was also the most
frequent agent in mixed infections (11/15). Importantly, positive and negative multiplex
results were confirmed in individual reactions for each agent. In conclusion, we described an
end-point multiplex PCR/RT-PCR for faster, easier and more efficient NCD diagnosis, which
may be useful in future clinical and surveillance studies. | eng |
dc.language | por | por |
dc.publisher | Universidade Federal de Santa Maria | por |
dc.rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International | * |
dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ | * |
dc.subject | Diarreia neonatal | por |
dc.subject | Rotavírus bovino | por |
dc.subject | Coronavírus bovino | por |
dc.subject | Salmonella enterica | por |
dc.subject | Escherichia coli K99 | por |
dc.subject | Cryptosporidium parvum | por |
dc.subject | Calf diarrhea | eng |
dc.subject | Bovine rotavirus | eng |
dc.subject | Bovine coronavirus | eng |
dc.title | Um PCR/RT-PCR multiplex para detecção de cinco agentes da diarreia neonatal bovina | por |
dc.title.alternative | An end-point multiplex PCR/RT-PCR for detection of five agents of bovine neonatal diarrhea | eng |
dc.type | Dissertação | por |
dc.description.resumo | A diarreia neonatal bovina (DNB) é uma doença complexa que acomete bezerros,
especialmente no primeiro mês de vida, e é responsável por altas perdas econômicas, sendo
um grande desafio sanitário em rebanhos bovinos de corte e leite. A DNB possui etiologia
multifatorial, sendo frequentemente associada a infecções simples ou coinfecções por vírus,
bactérias e protozoários. Consequentemente, o diagnóstico laboratorial da DNB geralmente
requer testes específicos para cada potencial agente, um processo que pode ser demorado,
laborioso, complexo e oneroso. Nesse contexto, descreve-se um PCR/RT-PCR multiplex
convencional (end-point), baseado em one-step RT-PCR, para detecção individual ou
simultânea dos cinco principais agentes da DNB: rotavírus bovino (BRV), coronavírus bovino
(BCoV), Escherichia coli K99 (E. coli K99), Salmonella enterica (S. enterica) e
Cryptosporidium parvum (C. parvum). Inicialmente, foram selecionados e/ou desenhados
primers de alta cobertura para os agentes alvos. Em seguida, padronizou-se o PCR/RT-PCR
multiplex, otimizando o mix (concentração de primers e volume de enzima) e as condições do
ensaio (desnaturação inicial, temperatura de anelamento e extensão e número de ciclos). Após
a otimização da reação, avaliou-se a sensibilidade analítica do multiplex para os cinco alvos e,
em seguida, avaliou-se o desempenho diagnóstico do ensaio, pelo teste de 95 amostras de
fezes diarreicas de bezerros. A especificidade analítica foi avaliada contra outros patógenos de
bovinos: vírus da diarreia viral bovina (BVDV), E. coli enterotoxigênica (STa) e Eimeria spp.
O limite de detecção do PCR/RT-PCR multiplex foi de 10 unidades infecciosas de BRV,
diluição 10-2 de um pool de amostras positivas para BCoV, 5 x 10-4 UFC para S. enterica, 5 x
10-6 UFC para E. coli K99 e 50 oocistos para C. parvum. Não foram observadas amplificações
inespecíficas de outros potenciais agentes de diarreia bovina. Entre as 95 amostras de fezes
analisadas, 50 (52,6%) foram positivas para pelo menos um alvo, sendo 35 infecções por um
agente e 15 coinfecções. O BRV foi o agente mais frequente em monoinfecções (16/35),
seguido por Cryptosporidium spp. (11/35), que também foi o alvo mais comum nas
coinfecções (11/15). Todos os resultados positivos e negativos do multiplex foram
confirmados em reações individuais específicas para cada agente. Dessa forma, desenvolveuse
um PCR/RT-PCR multiplex convencional para o diagnóstico mais rápido, fácil e eficiente
da DNB, uma estratégia que pode ser útil em futuros estudos clínicos e de vigilância. | por |
dc.contributor.advisor1 | Flores, Eduardo Furtado | |
dc.contributor.advisor1Lattes | http://lattes.cnpq.br/0446078331070694 | por |
dc.contributor.advisor-co1 | Silva Júnior, José Valter Joaquim | |
dc.contributor.referee1 | Cargnelutti, Juliana Felipetto | |
dc.contributor.referee2 | Gomes, Viviani | |
dc.creator.Lattes | http://lattes.cnpq.br/4664021600302639 | por |
dc.publisher.country | Brasil | por |
dc.publisher.department | Medicina Veterinária | por |
dc.publisher.initials | UFSM | por |
dc.publisher.program | Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária | por |
dc.subject.cnpq | CNPQ::CIENCIAS AGRARIAS::MEDICINA VETERINARIA | por |
dc.publisher.unidade | Centro de Ciências Rurais | por |