Estudo de métodos cromatográficos e ensaio biológico para avaliação do anticorpo monoclonal denosumabe
Resumo
O denosumabe (DmAb) é um anticorpo monoclonal totalmente humano que inibe diretamente a proliferação e atividade de células osteoclásticas e induz um aumento da massa óssea. Estruturalmente, é uma imunoglobulina do tipo IgG2, expressa pela tecnologia do DNA recombinante através da clonagem e propagação na linhagem celular CHO. Apresenta massa molecular de 147 kDa. O DmAb encontra-se disponível comercialmente no Brasil, e é indicado clinicamente para o tratamento da osteoporose de alto risco de fraturas em mulheres pós-menopausa e da perda óssea de pacientes submetidos a terapias que causam diminuição hormonal, como câncer de mama e de próstata. Também é recomendado para pacientes com metástase óssea de tumores sólidos. Neste trabalho foram desenvolvidos e validados métodos por cromatografia líquida por exclusão molecular (CL–EM) e cromatografia líquida em fase reversa (CL–FR) para a avaliação de DmAb em produtos biofarmacêuticos. Além disso, foi desenvolvido bioensaio por cultura de células de macrófagos RAW 264,7 in vitro para avaliar a atividade biológica. No método por CL–EM utilizou-se coluna TSKGel G2000SWXL (300 mm × 7,8 mm d.i.), mantida a 25 ºC. A fase móvel foi constituída de solução tampão fosfato de potássio monobásico 1 mM, fosfato de potássio dibásico 8 mM e cloreto de sódio 200 mM, pH 7,4, com eluição isocrática de 1,0 mL/min e detecção por detector de arranjo de diodos (DAD) em 214 nm. No método por CL–FR, foi utilizada coluna Vydac 214TP C4 (250 mm × 4,6 mm d.i.) mantida a 60 ºC, fase móvel constituída de ácido trifluoroacético (TFA) 0,1% (v/v) em água e TFA 0,1% (v/v) em acetonitrila, com eluição por gradiente, fluxo de 1 mL/min e detecção por DAD em 214 nm. Os tempos de retenção do DmAb foram de 7,6 e 18,2 min, para os métodos por CL–EM e CL–FR, respectivamente. A especificidade foi verificada e confirmada por estudos de degradação forçada, avaliação da interferência dos excipientes da formulação e pureza dos picos. As curvas de calibração dos métodos por CL–EM e CL–FR foram lineares nas faixas de concentração de 5 – 200 μg/mL (r2 = 0,9993) e 5 – 300 μg/mL (r2 = 0,9997) e os limites de detecção e quantificação foram de 1,83 e 5,54 μg/mL e 1,94 e 5,87 μg/mL, respectivamente. As médias da exatidão foram de 100,53 e 100,80%, com bias inferior a 0,84 e 1,25%, respectivamente. O bioensaio in vitro foi realizado em células de macrófagos RAW 264,7 que se diferenciaram em osteoclastos pela adição de RANKL e M−CSF, avaliando a capacidade do DmAb em inibir a formação osteoclástica induzida pelo RANKL. Os métodos por CL foram aplicados para a quantificação de DmAb e suas formas degradadas em formulações biofarmacêuticas, e os resultados foram correlacionados com os obtidos pelo bioensaio antiproliferativo da osteoclastogênese, apresentando correlação significativa (p < 0,05). Assim, sugere-se que os métodos por CL validados sejam aplicados paralelamente ao bioensaio in vitro para aprimorar o controle da qualidade do produto biotecnológico de DmAb, contribuindo para garantir sua segurança e eficácia terapêutica.
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