Vírus vaccínia isolados de equinos: patogenia em modelos animais e análise de genes de virulência
Resumo
Duas amostras de vírus vaccínia (VACV) geneticamente e fenotipicamente distintas foram isoladas de um mesmo animal em um surto de doença vesicular e exantemática em equinos no Rio Grande do Sul, e denominados Pelotas 1 (P1V) e Pelotas 2 (P2V). Esta tese descreve estudos realizados para investigar a patogenia dos isolados P1V e P2V em coelhos e cobaias, e analisar a sequência de genes potencialmente envolvidos no fenótipo desses isolados. O Capítulo 1 relata a investigação da susceptibilidade dose-dependente de coelhos ao P1V e P2V. Os animais foram inoculados pela via intranasal (IN) com três doses (102,5 DICC50, 104,5 DICC50 e 106,5DICC50/coelho) de cada um dos isolados. A inoculação resultou em enfermidade respiratória grave e morte na maioria dos coelhos, independente do isolado utilizado. Os sinais clínicos iniciaram nos dias 3 e 6 pós-inoculação (pi) e culminaram com a morte ou eutanásia dos animais, 5 a 10 dias pi. Viremia foi detectada em coelhos de todos os grupos. Anticorpos neutralizantes foram detectados em todos os animais que sobreviveram além do dia 9 pi. Pneumonia intersticial com broncopneumonia necrossupurativa e conteúdo líquido intestinal foram lesões observadas em animais inoculados com o P1V ou P2V que evoluíram para a morte ou foram motivo para a eutanásia in extremis. Esses resultados demonstram que P1V e P2V são virulentos para coelhos e não apresentam diferenças evidentes de patogenia nessa espécie. No Capítulo 2 foi investigada a susceptibilidade de coelhos após inoculação de VACV pela via intradérmica (ID). Para isso, os coelhos foram inoculados com um dos isolados ou com ambos. Todos os coelhos inoculados apresentaram lesões de pele caracterizadas por hiperemia, pápulas, vesículas, pústulas e úlceras. Excreção viral foi detectada nas lesões cutâneas e também em amostras de pulmão e intestino de animais que morreram durante a fase aguda da infecção. Os resultados desta inoculação demonstraram que coelhos desenvolvem doença cutânea e sistêmica após a inoculação ID de P1V e P2V. Algumas evidências indicam que os coelhos co-infectados desenvolveram lesões mais severas do que na infecção simples. No Capítulo 3, investigou-se a susceptibilidade e o potencial de transmissibilidade dos isolados P1V e P2V por cobaias. Para isso, cobaias foram inoculadas pela via intranasal (IN) com uma mistura dos isolados P1V e P2V (106 DICC50/ml). As cobaias não apresentaram sinais clínicos, porém excretaram o vírus nas secreções nasais, desenvolveram viremia e soroconverteram para VACV. Apesar disso, o vírus não foi transmitido a sentinelas por contato direto, indireto (aerossóis) ou por água e alimentos contaminados com fezes deliberadamente infectadas com o vírus. No Capítulo 4, quatro genes (C7L, K2L, N1L e B1R) envolvidos no fenótipo do VACV foram amplificados por PCR, sequenciados e submetidos à análise molecular. Uma deleção de 15 nucleotídeos (nt) no gene K2L foi identificada no P2V. Essa mesma deleção também foi identificada em isolados brasileiros do VACV pertencentes ao genogrupo 1. Mutações pontuais foram identificadas nos genes K2L, C7L e N1L no P2V comparando-se com o P1V e cepas de referência do VACV. A análise molecular desses genes não permite associar essas deleções/mutações presentes no P2V com o fenótipo, mas sugere que a deleção de 15 nt no gene K2L possa ser utilizado como marcador molecular de isolados de VACV do genogrupo 1. Em resumo, os resultados obtidos nesses experimentos demonstram que: i. P1V e P2V produzem doença sistêmica e cutânea em coelhos, mas não diferem fenotipicamente nessas espécies; ii. cobaias são susceptíveis à infecção mista pelo P1V e P2V, mas aparentemente não transmitem o vírus com eficiência; iii. P1V e P2V apresentam algumas diferenças em genes de virulência, sendo que a deleção de 15 nt no gene K2L pode ser utilizada como marcador de genogrupos de VACV.