Detecção de proteínas envolvidas no remodelamento da cromatina de embriões bovinos produzidos in vitro a partir de oócitos oriundos de folículos antrais pequenos e grandes
Fecha
2006-06-26Primeiro membro da banca
Bordignon, Vilceu
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Mostrar el registro completo del ítemResumen
Tem sido demonstrado que oócitos de várias espécies adquirem capacidade para completar a
maturação meiótica e suportar o desenvolvimento embrionário durante os estágios finais do crescimento
folicular. Com o objetivo de investigar diferenças moleculares entre embriões bovinos produzidos a partir de
oócitos derivados de folículos pequenos (1-2 mm) e grandes (4-8 mm), dois experimentos foram delineados
visando identificar por imunocitoquimica a presença de três fatores reguladores da cromatina envolvidos
principalmente nos processos de transcrição e reparo do DNA. No primeiro experimento, foi investigado se o
perfil de expressão das proteínas (do inglês) High-Mobility Group N2 (HMGN2) e histona H3 acetilada na
lisina 14 (Ac.H3K14) seria alterado pela origem dos oócitos (folículos pequenos vs. folículos grandes) e pelo
tempo necessário para realizar a primeira clivagem (<24 h vs. >24 h) após ativação partenogenética (AP).
Embriões clivados cedo (até 24 h) e tarde (após 24 h) foram fixados às 36, 50, 60, 70 e 80 h após AP e
processados para detectar a HMGN2 ou Ac.H3K14. Os percentuais de maturação nuclear (81% vs. 59%),
clivagem cedo (47% vs. 39%) e blastocisto (34% vs. 19%) foram significativamente maiores (P<0,05) nos
oócitos oriundos de folículos grandes em comparação aos de folículos pequenos. Os percentuais de núcleos
positivos para Ac.H3K14 (61% vs. 38%) e HMGN2 (74% vs. 56%) às 60 h após AP foram maiores (P<0,05)
nos embriões produzidos a partir de oócitos de folículos pequenos comparado aos de folículos grandes.
Entretanto, um maior percentual de núcleos positivos para HMGN2 (94% vs. 75%; P<0,05) foi detectado em
embriões produzidos com oócitos de folículos grandes às 80 h após a AP. Concluiu-se que a proporção de
núcleos com sinal positivo para HMGN2 e Ac.H3K14 é dependente do tamanho dos folículos e do tempo
transcorrido para os oócitos realizarem a primeira clivagem. No segundo experimento, foi investigado se o
perfil de fosforilação da proteína histona H2A.X (γH2A.X), que é um indicador de rompimento da cadeia
dupla do DNA, seria diferente em embriões produzidos a partir de oócitos oriundos de folículos pequenos ou
grandes. Os oócitos foram submetidos à AP ou fertilização in vitro (FIV) por 18 h e, então, cultivados. A
clivagem foi avaliada 24 e 36 h após a AP e 32 e 42 h após FIV. Os embriões clivados foram fixados 36 h após
AP e 42 h após FIV, e então processados para detectar a presença da γH2A.X. A maioria dos embriões
produzidos a partir de oócitos submetidos à AP e FIV apresentou quantidades detectáveis de γH2A.X,
variando entre poucos focos até um sinal completamente difuso no núcleo. A γH2A.X foi detectada em 64%
vs. 76% (P<0,05) dos núcleos dos embriões ativados e em 76% vs. 80% (P<0,05) dos núcleos dos embriões de
FIV produzidos a partir de oócitos oriundos de folículos pequenos e grandes, respectivamente. Embriões
oriundos de FIV que apresentaram número <4 núcleos às 42 h tiveram maiores percentuais (P<0,05) de
núcleos positivos para γH2A.X (89% e 85%) do que os que apresentaram número ≥4 núcleos (72% e 62%,
respectivamente para folículos pequenos e grandes). Foi demonstrado que a γH2A.X é altamente detectada
mas não é diferentemente expressa em embriões bovinos produzidos a partir de oócitos oriundos de folículos
pequenos e grandes e submetidos à AP ou FIV. Em geral, os experimentos demonstraram que as proteínas
HMGN2, Ac.H3K14 e γH2A.X são expressas durante o desenvolvimento embrionário precoce em bovinos.