Estudo de metodologias para avaliação do hormônio da paratireóide humano recombinante
Resumo
O hormônio da paratireóide humano (hPTH) é um polipeptídio constituído de 84
aminoácidos e tem função essencial como regulador da homeostase dos íons cálcio e fosfato,
e manutenção da estrutura óssea. O hormônio da paratireóide humano recombinante, rhPTH
(1-34), é produzido pela tecnologia do DNA em Escherichia coli, apresenta a sequência de
aminoácidos responsável pela porção biologicamente ativa do paratormônio natural e é usado
clinicamente para o tratamento da osteoporose de alto risco de fraturas em mulheres pósmenopausa
e de homens com osteoporose primária ou hipogonadal. No presente trabalho
foram desenvolvidos e validados métodos por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR)
e por exclusão molecular (CL-EM) para a avaliação de rhPTH (1-34) em formulações de
produtos biofarmacêuticos. No método por CL-FR, foi utilizada coluna Zorbax 300 SB C18
(150 mm x 4,6 mm d.i.), mantida a 40 ºC. A fase móvel A foi constituída por tampão sulfato
de sódio 0,1 M, pH 2,3, e a fase móvel B por acetonitrila, eluídas em gradiente. No método
por CL-EM foi utilizada coluna BioSep-SEC-S 2000 (300 mm x 7.8 mm d.i.), mantida a 25
ºC. A fase móvel foi contituída de tampão ácido fosfórico 0,1 M, pH 2,5, eluída em vazão
isocrática de 0,7 mL/min. Para ambos os métodos utilizou-se detector de arranjo de diodos
(DAD) a 214 nm. A separação cromatográfica foi obtida nos tempos de 12,2 e 13,2 min,
sendo linear na faixa de concentração de 1-250 μg/mL (r2 = 0,9997) e 1-300 μg/mL (r2 =
0,9993), respectivamente, para os métodos por CL-FR e CL-EM. Os limites de detecção e
quantificação foram 0,44 e 1,47 μg/mL, respectivamente, para o método por CL-FR e 0,79 e
2,63 por CL-EM. A especificidade foi avaliada em estudos de degradação, que também
demonstraram que não houve interferência dos excipientes. A exatidão foi 100,49 e 100,22,
com bias inferior a 1,12 e 0,81, respectivamente, para os métodos por CL-FR e CL-EM. Além
disso, realizou-se o teste de citotoxicidade in vitro das formas degradadas, as quais
apresentaram diferença significativa em relação a forma intacta (p<0,05). O métodos
propostos foram aplicados para avaliação da potência de rhPTH (1-34) e de proteínas
relacionadas em formulações biofarmacêuticas, e os resultados foram comparados com os
bioensaios, observando-se diferenças das médias de teor/potência 0,64% e 1,31% inferiores
para os métodos por CL-FR e CL-EM, em relação ao bioensaio in vivo, e 0,98% e 0,31%
superiores, respectivamente, em relação ao in vitro. Contribuíu-se assim para estabelecer
procedimentos que aprimoram o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia
terapêutica do produto biotecnológico.