Automação e validação do método de oxidação do NADPH para a mensuração da atividade da glutationa redutase: determinação dos limites de referência e avaliação da influência da lipemia, hemoglobina e bilirrubina
Resumo
A glutationa (L-γ-glutamil-L-cysteinylglycine) é o principal tiol não proteico do organismo e está envolvida na defesa celular antioxidante. A glutationa livre está presente principalmente na sua forma reduzida (GSH) e pode ser convertida para a forma oxidada (GSSG) na presença de espécies reativas de oxigênio (EROs). A razão GSH/GSSG elevada é muito importante para o estado redox celular e uma redução desta razão é frequentemente utilizada como um indicador do estresse oxidativo. A enzima glutationa redutase (GR) catalisa a redução de GSSG a GSH utilizando NADPH. Devido a grande importância antioxidante da glutationa e considerando que a mesma está presente em quase todos os organismos, numerosas pesquisas envolvendo as mais diversas tentativas de detecção de GSH, GSSG e GR em sistemas biológicos tem sido realizadas. Assim, o objetivo deste estudo foi validar um método analítico automatizado, baseado em um método espectrofotométrico proposto por Mannervick e Carlberg em 1985 para a mensuração da atividade da GR que consiste na oxidação do NADPH, o qual é monitorado espectrofotometricamente no comprimento de onda de 340 nm utilizando o analisador automatizado Cobas Mira®, determinar seus limites de referência para uma população saudável e ainda avaliar a interferência pré-analítica que influenciam na fase analítica da hemoglobina, lipemia e bilirrubina. O método automatizado para a mensuração da atividade da enzima GR foi validado seguindo recomendações da ANVISA e EMEA. Sendo que o mesmo foi linear (r2=0,990), preciso, apresentando um coeficiente de variação (CV) na precisão intraensaio de 5,7% (50 U/L) e 3,4% (100 U/L) e na precisão interensaio um CV de 9,5% (50U/L) e 9,9% (100 U/L). Além disso, foi observada uma recuperação de 114,1%, sendo este método considerado exato. Os limites de referência foram avaliados seguindo recomendações da International Federation of Clinical Chemistry (IFCC), sendo que foram de 21,7 U/L a 60,3 U/L, para uma população saudável. Na simulação da hemólise, lipemia e icterícia em amostras de plasma, avaliou-se a interferência pré-analítica na atividade da GR. Todas as concentrações utilizadas de Intralipid® (0,67; 1,25; 2,5; 5 e 10 mg/dL), de padrão de hemoglobina (0,0625; 0,125; 0,25; 0,5 e 1 g/dL) e de bilirrubina (0,9; 1,9; 3,8; 7,5; 15 e 30 mg/dL) resultaram em uma diferença do valor original de GR, sendo verificada uma porcentagem maior que 5%, sendo essa porcentagem considerada, para enzimas, interferência analítica. Dessa forma, foi possível concluir que o método automatizado desenvolvido foi linear, preciso, exato, simples e de baixo custo, podendo ser adaptado ao analisador Cobas Mira®. Os limites de referência para uma população saudável também foram estabelecidos. Além disso, foi demonstrado que a hemoglobina, a lipemia e a bilirrubina interferem na mensuração da atividade da GR.