Desenvolvimento e validação de métodos cromatográficos para avaliação de teor/potência de insulina glargina
Date
2016-03-30Author
Schramm, Vanessa Grigoletto 
Primeiro orientador
Dalmora, Sergio Luiz
Primeiro membro da banca
Macedo, Rui Oliveira
Segundo membro da banca
Codevilla, Cristiane Franco
Metadata
Show full item recordAbstract
A insulina humana é um hormônio secretado pelas células β, das ilhotas de
Langerhans, e regula os níveis sanguíneos de glicose. A insulina glargina é produzida pela
tecnologia do DNA recombinante, expressa em Escherichia coli, e difere da insulina humana
pela modificação da aspargina na posição 21 da cadeia A por uma glicina, além da adição de
dois resíduos de arginina C-terminais na cadeia B. No presente trabalho foram desenvolvidos
e validados métodos por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) e por exclusão
molecular (CL-EM) para a avaliação de insulina glargina em formulações biofarmacêuticas.
No método por CL-FR, foi utilizada coluna Júpiter C4 (250 mm x 4,6 mm d.i.), mantida a 30
ºC. A fase móvel A foi constituída por tampão sulfato de sódio 0,05 M, pH 2,5, e a fase móvel
B por acetonitrila, eluídas com fluxo constante de 0,5 mL/min. No método por CL-EM foi
utilizada coluna BioSep-SEC-S 2000 (300 mm x 7.8 mm d.i.), mantida a 25 ºC. A fase móvel
foi constituída de tampão MES 0,03 M, pH 2,5, eluída em vazão isocrática de 0,6 mL/min.
Para ambos os métodos utilizou-se detector de arranjo de diodos (DAD) com detecções em
214 nm e 200 nm para CL-FR e CL-EM, respectivamente. A separação cromatográfica foi
obtida nos tempos de 7,5 e 9,9 min, sendo linear na faixa de concentração de 0,05 - 200
μg/mL (R2 = 0,9998) e 0,02 - 180 μg/mL (R2 = 0,9999), respectivamente, para os métodos
por CL-FR e CL-EM. Os limites de detecção e quantificação foram 0,018 e 0,054 μg/mL,
respectivamente, para o método por CL-FR e 0,009 e 0,027 μg/mL por CL-EM. A
especificidade foi avaliada em estudos de degradação, que também demonstraram que não
houve interferência dos excipientes. A exatidão foi 100,13 e 99,38%, com bias inferior a 0,85
e 0,86%, respectivamente, para os métodos por CL-FR e CL-EM. Os métodos propostos
foram aplicados para avaliação da potência de insulina glargina, de proteínas relacionadas
agregados de alta massa molecular em formulações biofarmacêuticas, e os resultados foram
comparados com o bioensaio por cultura de células in vitro, observando-se diferenças das
médias de teor/potência 0,21% e 0,16% inferiores para os métodos por CL-FR e CL-EM.
Concluí-se que representa contribuição para estabelecer procedimentos para monitorar a
estabilidade, o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do
produto biotecnológico.