Validação de métodos cromatográficos para avaliação de estreptoquinase e correlação com o bioensaio
Abstract
A estreptoquinase (STK) é uma molécula secretada e isolada de estreptococos β-hemolíticos,
constituída de 414 aminoácidos e clinicamente indicada como agente trombolítico para o
infarto agudo do miocárdio, trombose venosa profunda, embolia pulmonar, trombose arterial
periférica aguda ou subaguda. No presente trabalho foram desenvolvidos e validados métodos
por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) e por exclusão molecular (CL-EM) para a
avaliação de STK em formulações de produtos biofarmacêuticos. No método por CL-FR foi
utilizada coluna Jupiter C4 (250 mm x 4,6 mm d.i.), Phenomenex, mantida a 25ºC. A fase
móvel A foi constituída por tampão sulfato de sódio 50 mM, pH 7,0, e a fase móvel B por
metanol (90:10, v/v), eluída sob fluxo isocrático de 0,8 mL/min. No método por CL-EM foi
utilizada coluna Protein KW-802.5 (300 mm x 8,0 mm d.i.), Shodex, mantida a 25ºC. A fase
móvel foi constituída de tampão acetato de sódio 40 mM, pH 7,0, eluída em vazão isocrática
de 1,0 mL/min. Utilizou-se detector de arranjo de diodos (DAD) a 220 nm e 204 nm, para
CL-FR e CL-EM, respectivamente. A separação cromatográfica foi obtida nos tempos de 19,3
min e 14,1 min, sendo linear na faixa de concentração de 85 - 25 000 UI/mL (R2 = 0,9999) e
600 – 8 000 UI/mL (R2 = 0,9991), respectivamente, para os métodos por CL-FR e CL-EM. Os
limites de detecção e quantificação foram 26 e 85 UI/mL, respectivamente, para o método por
CL-FR e 190 e 600 UI/mL por CL-EM. A especificidade foi avaliada em estudos de
degradação, e demonstrou-se também que não houve interferência dos excipientes. A exatidão
foi 100,24% e 99,88%, com bias inferior a 0,99% e 0,62%, respectivamente, para os métodos
por CL-FR e CL-EM. Os métodos propostos foram aplicados para a avaliação da potência de
STK, de formas degradadas ou alteradas, de proteínas relacionadas e de alta massa molecular
em formulações biofarmacêuticas, e os resultados foram comparados com o bioensaio
cromogênico, observando-se diferenças das médias de teor/potência 0,46% e 0,53%
superiores para os métodos por CL-FR e CL-EM, respectivamente. Concluiu-se que o
trabalho representa contrbuição para estabelecer novas alternativas para monitorar a
estabilidade e o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do
produto biotecnológico. Do mesmo modo, também estabelecem bases para estudos de
comparabilidade de biomoléculas, garantindo a segurança e eficácia.
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