Avaliação de potência de interferon beta -1b por métodos cromatográficos validados e bioensaio
Abstract
O interferon é uma citocina que apresenta ação antiviral, antiproliferativa e imunomoduladora, e influencia o metabolismo, crescimento e diferenciação das células. O interferon β 1b humano recombinante (rhIFNβ-1b) não-glicosilado, é produzido por engenharia genética, e expresso em Escherichia coli. Estruturalmente possui 165 aminoácidos, massa molecular de 18,5 KDa e ponto isoelétrico de 9,2. O rhIFNβ-1b é indicado clinicamente para o tratamento de esclerose múltipla. No presente trabalho foram desenvolvidos e validados métodos por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) e por exclusão molecular (CL-EM) para avaliação do rhIFNβ-1b em formulações de produtos biofarmacêuticos. No método por CL-FR, foi utilizada coluna Jupiter C4 (250 mm x 4,6 mm d.i), mantida a 30°C. A fase móvel A foi constituída de ácido trifluoracético (TFA) 0,1% (v/v) em água, e a fase móvel B por TFA 0,1% (v/v) em acetonitrila, eluídas em gradiente com fluxo de 1 mL/min. No método por CL-EM foi utilizada coluna BioSep-SEC-S 2000 (300 mm x 7.8 mm d.i), mantida a 25°C. A fase móvel foi constituída de tampão fosfato de potássio monobásico 1 mM, fosfato de sódio dibásico 8 mM e cloreto de sódio 200 mM, pH 7,4, eluída em vazão isocrática de 0,8 mL/min. Para ambos os métodos utilizou-se detector de arranjo de diodos (DAD) a 214 nm. A separação cromatográfica foi obtida nos tempos de 31,87 e 17,78 min, respectivamente, para os métodos por CL-FR e CL-EM. As curvas de calibração foram lineares na faixa de concentração de 1–200 μg/mL (0,032-6,4 MUI/mL) (r2 = 0,9998) e 0,50–200 μg/mL (0,016-6,4 MUI/mL) (r2 = 0,9999), respectivamente, para os métodos por CL-FR e CL-EM. Os limites de detecção e quantificação foram 0,47 e 1,57 μg/mL, respectivamente, para o método por CL-FR e 0,10 e 0,34 μg/mL por CL-EM. A especificidade foi avaliada em estudos de degradação, e também demonstrou-se que não houve interferência dos excipientes. A exatidão foi de 100,42 e 100,45% com bias inferiores a 0,69 e 0,82%, respectivamente. Além disso, realizou-se o teste de citotoxicidade in vitro das formas degradadas, as quais apresentaram diferença significativa em relação a forma intacta (p < 0,05). Os métodos propostos foram aplicados para avaliação da potência de rhIFNβ-1b em formulações biofarmacêuticas, e os resultados foram comparados com bioensaio, observando-se diferenças das médias de teor/potência de 1,61 e 1,05% superiores para os métodos por CL-FR e CL-EM. Conclui-se que a pesquisa representa contribuição para estabelecer procedimentos, para monitorar a estabilidade e aprimorar o controle de qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biotecnológico.
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