Estudo de métodos físico-químicos e biológico para caracterização e avaliação do anticorpo monoclonal recombinante denosumabe
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Data
2021-10-21Primeiro membro da banca
Silva, Carine Viana
Segundo membro da banca
Bajerski, Lisiane
Terceiro membro da banca
Sangoi, Maximiliano da Silva
Quarto membro da banca
Horner, Rosmari
Metadata
Mostrar registro completoResumo
O denosumabe (DmAb) é um anticorpo monoclonal (mAb) que inibe a proliferação e atividade de células osteoclásticas e encontra-se disponível comercialmente no Brasil como Prolia® e Xgeva®, para tratamento de doenças ósseas. Estruturalmente, apresenta duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, com massa molecular de 147 kDa. A região região do fragmento cristalizável (Fc) das cadeias pesadas apresenta sítios de N-glicosilação, onde se ligam estruturas com resíduos de ácido siálico. Neste trabalho, desenvolveu-se e validou-se método por eletroforese capilar de zona (ECZ) para a avaliação de DmAb e suas variantes de carga em produtos biofarmacêuticos. Foi utilizado capilar de sílica fundida não revestido (50 μm d.i., 56 cm) e solução eletrolítica composta de tampão ácido épsilon-aminocaproico (EACA) 300 mmol/L e trietilenotetramina (TETA) 2 mmol/L, pH 4,8, adicionado de Tween 20 0,03% (v/v). As amostras de DmAb foram analisadas na concentração de 5 mg/mL, adicionadas de padrão interno. Paralelamente, determinou-se o conteúdo de ácidos siálicos da biomolécula de DmAb por cromatografia líquida em fase reversa com detecção por fluorescência (CL‒FR‒F), utilizando coluna C18 Kinetex® EVO (5 μm d.i., 100 Å, 250 mm × 4,6 mm). Os resíduos de ácidos siálicos foram liberados da molécula de DmAb por reação com bissulfito de sódio 0,5 mol/L (80 ºC, 20 min), seguida de derivatização com ortofenilenodiamina (OPD) 40 mg/mL (80 ºC, 40 min). Além disso, o bioensaio in vitro foi validado utilizando células de macrófagos RAW 264,7 (ATCC® TIB−71TM) que se diferenciaram em osteoclastos. A potência do DmAb foi avaliada pela capacidade de inibir a formação osteoclástica induzida in vitro. A separação eletroforética foi obtida com tempo de migração de 18,1 min para o DmAb. O método por ECZ demonstrou-se específico, exato (101,61%) e robusto e foi então aplicado em conjunto com métodos por cromatografia líquida por exclusão molecular e em fase reversa (CL‒EM e CL‒FR), previamente validados, e com o bioensaio in vitro, para quantificação de DmAb em sete lotes de Prolia®, fornecendo valores médios de teores/potências entre 98,44% e 101,52%. Estes resultados foram comparados, demonstrando correlação significativa (r > 0,98). Os métodos analíticos também permitiram monitorar a presença de variantes de carga, proteínas de alta massa molecular e fragmentos de DmAb. No método por CL‒FR‒F, foram separados três picos cromatográficos referentes aos ácidos siálicos da biomolécula de DmAb, com tempos de retenção de 9,2, 10,9, e 12,0 min. Os produtos biofarmacêuticos Prolia® e Xgeva® apresentaram 0,16 e 0,17 μg ácidos siálicos/mg DmAb, respectivamente. Por fim, após estudos de validação, o bioensaio in vitro demonstrou-se específico, exato (102,33%) e robusto para avaliação de potência de DmAb e foi aplicado em conjunto com método por CL‒EM para quantificação de DmAb em de seis lotes de Prolia®, fornecendo valores médios de teores/potências de 100,80% e 100,87%, respectivamente. Sendo assim, sugere-se que os métodos analíticos e o bioensaio in vitro sejam aplicados em conjunto para análise dos produtos biotecnológicos de DmAb, estabelecendo uma ferramenta analítica que assegurará a qualidade dos produtos e que servirá de base para futuros estudos de biossimilaridade de DmAb.
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