Um PCR/RT-PCR multiplex para detecção de cinco agentes da diarreia neonatal bovina
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Date
2023-02-07Primeiro coorientador
Silva Júnior, José Valter Joaquim
Primeiro membro da banca
Cargnelutti, Juliana Felipetto
Segundo membro da banca
Gomes, Viviani
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A diarreia neonatal bovina (DNB) é uma doença complexa que acomete bezerros,
especialmente no primeiro mês de vida, e é responsável por altas perdas econômicas, sendo
um grande desafio sanitário em rebanhos bovinos de corte e leite. A DNB possui etiologia
multifatorial, sendo frequentemente associada a infecções simples ou coinfecções por vírus,
bactérias e protozoários. Consequentemente, o diagnóstico laboratorial da DNB geralmente
requer testes específicos para cada potencial agente, um processo que pode ser demorado,
laborioso, complexo e oneroso. Nesse contexto, descreve-se um PCR/RT-PCR multiplex
convencional (end-point), baseado em one-step RT-PCR, para detecção individual ou
simultânea dos cinco principais agentes da DNB: rotavírus bovino (BRV), coronavírus bovino
(BCoV), Escherichia coli K99 (E. coli K99), Salmonella enterica (S. enterica) e
Cryptosporidium parvum (C. parvum). Inicialmente, foram selecionados e/ou desenhados
primers de alta cobertura para os agentes alvos. Em seguida, padronizou-se o PCR/RT-PCR
multiplex, otimizando o mix (concentração de primers e volume de enzima) e as condições do
ensaio (desnaturação inicial, temperatura de anelamento e extensão e número de ciclos). Após
a otimização da reação, avaliou-se a sensibilidade analítica do multiplex para os cinco alvos e,
em seguida, avaliou-se o desempenho diagnóstico do ensaio, pelo teste de 95 amostras de
fezes diarreicas de bezerros. A especificidade analítica foi avaliada contra outros patógenos de
bovinos: vírus da diarreia viral bovina (BVDV), E. coli enterotoxigênica (STa) e Eimeria spp.
O limite de detecção do PCR/RT-PCR multiplex foi de 10 unidades infecciosas de BRV,
diluição 10-2 de um pool de amostras positivas para BCoV, 5 x 10-4 UFC para S. enterica, 5 x
10-6 UFC para E. coli K99 e 50 oocistos para C. parvum. Não foram observadas amplificações
inespecíficas de outros potenciais agentes de diarreia bovina. Entre as 95 amostras de fezes
analisadas, 50 (52,6%) foram positivas para pelo menos um alvo, sendo 35 infecções por um
agente e 15 coinfecções. O BRV foi o agente mais frequente em monoinfecções (16/35),
seguido por Cryptosporidium spp. (11/35), que também foi o alvo mais comum nas
coinfecções (11/15). Todos os resultados positivos e negativos do multiplex foram
confirmados em reações individuais específicas para cada agente. Dessa forma, desenvolveuse
um PCR/RT-PCR multiplex convencional para o diagnóstico mais rápido, fácil e eficiente
da DNB, uma estratégia que pode ser útil em futuros estudos clínicos e de vigilância.
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