SUPEREXPRESSÃO INDUZIDA DE VEGF E HGF EM CÉLULAS MESENQUIMAIS ESTROMAIS DERIVADAS LÍQUIDO AMNIÓTICO NA INIBIÇÃO DA FIBROSE INTERSTICIAL APÓS ISQUEMIA AGUDA EM RATOS
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Data
2012-08-17Autor
Cunha, Marina Gabriela Monteiro Carvalho Mori da 
Primeiro orientador
Pippi, Ney Luis
Primeiro membro da banca
Graça, Dominguita Luhers
Segundo membro da banca
Krause, Alexandre
Terceiro membro da banca
Guimaraes-okamoto, Priscylla Tatiana Chalfun
Quarto membro da banca
Krause, Luciana Maria Fontanari
Metadata
Mostrar registro completoResumo
O tratamento eficaz para a lesão renal aguda tem melhorado nos últimos anos, sendo objeto de inúmeras pesquisas, no entanto a taxa de mortalidade desta patologia ainda permanece elevada. Além disso, pacientes que sobrevivem após evento isquêmico possuem altos riscos de doença renal crônica progressiva. As células mesenquimais estromais do líquido amniótico humano (hAFSC) são uma nova fonte alternativa de células-tronco que expressam marcadores progenitores renais (CD24). A possibilidade da associação das terapias gênica e celular permite a manipulação dessas para superexpressar o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e o fator de crescimento de hepatócitos (HGF), dois dos fatores de crescimento mais importantes para a regeneração renal. Diante disso, o objetivo desse estudo foi avaliar se as hAFSCs transduzidas com VEGF e HGF possuem maior ação nefroprotetora, por meio de efeito mitótico e anti-inflamatório a curto prazo, levando a uma inibição da fibrose a longo prazo em modelos de isquemia e reperfusão renal. Na primeira fase do experimento, isolou-se, caracterizou-se as propriedades imunofenotípicas e a capacidade de diferenciação das hAFSCs e após selecionou-se uma linhagem clonal que expressasse os marcadores CD24 e CD117. Após essa linhagem foi transduzida com vetores lentivirais (VL) codificando VEGF e HGF. Na segunda fase, induziu-se lesão de isquemia e reperfusão (IR) renal pelo clampeamento do pedículo renal por 50 minutos, em 50 ratos Wistar, machos. O grupos de tratamento foram divididos como (n=10 por grupo): grupo controle, tratado somente com o meio Chang; grupo tratado com hAFSC não transduzidas (1x106/rato); grupo tratado com hAFSC transduzidas com LV-VEGF (1x106/rato); grupo tratado com hAFSC transduzidas com LV-HGF (1x106/rato) e o grupo tratado tanto com hAFSC transduzidas com LV-VEGF (0,5x106/rato) quanto LV-HGF (0,5x106/rato). A creatinina sérica foi mensurada em 24 horas, 48 horas e 2 meses após a lesão IR e as análises histológicas foram realizadas para avaliar os seguintes parâmetros: necrose tubular e formação de cilíndros hialinos pelas colorações de PAS e H&E em 48 horas e fibrose intersticial pelas colorações Tricrômico de Masson e Picrosirius Red em 2 meses Adicionalmente, a expressão de KI-67, -SMA e TGF- foram analisadas por imunoistoquímica em 48 horas. Os resultados permitiram observar um efeito benéfico da terapia com hAFSCs em lesões de IR pela melhora mais rápida da função renal e menor índice fibrótico a longo prazo, no entanto obteve-se um efeito ainda melhor quando associaram-se as hAFSCs. transduzidas com VEGF e HGF comparado com as hAFSC não transduzidas. Já em 24 h observou-se o efeito renoprotetor nos grupos hAFSC e hAFSC VEGF + HGF pelo valor significativamente menor da creatinina comparado com o controle. Em 48h todos os grupos ainda apresentavam valores significativamente elevados de creatinina comparado com os ratos sham, exceto o grupo hAFSC HGF + VEGF. Observou-se também que os grupos hAFSC VEGF +HGF e hAFSC VEGF tiveram um aumento significativo na proliferação tubular renal, provavelmente pelo efeito da superexpressão de VEGF. Além disso, observou-se redução da expressão de α-SMA e TGF-β em 48h nos grupos hAFSCs não-transduzidas, hAFSC VEGF+HGF e hAFSC HGF. Como o TGF- β1 está envolvido na transdiferenciação de células epiteliais tubulares em miofibroblastos α-SMA-positivos, o qual aumenta a deposição de matriz extracelular, a redução na expressão de α-SMA e TGF-β são indicadoras de inibição da fibrose. Apesar de serem descritos diversos benefícios nefroprotetores do VEGF e do HGF observou-se nesse estudo uma lesão renal mais pronunciada do que o controle nos grupos hAFSC VEGF e hAFSC HGF, tanto em relação à função renal quanto à necrose tubular, o que sugere um efeito tóxico causado pela alta concentração de secreção desses fatores de crescimento. A terapia celular utilizando a combinação de hAFSCs transduzida com vetores lentivirais codificando VEGF e HGF resultou em efeito nefroprotetor ainda maior do que sua forma não transduzida após evento isquêmico renal, o qual foi caracterizado pelo aumento do índice mitogênico, melhor função renal e inibição de genes fibrogênicos, levando a um menor índice fibrótico em dois meses.