Diagnóstico molecular e filogenia de morbilivírus canino
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Data
2023-03-09Primeiro coorientador
Silva Júnior, José Valter Joaquim
Primeiro membro da banca
Weiblen, Rudi
Segundo membro da banca
Lima, Marcelo de
Terceiro membro da banca
Budaszewski, Renata da Fontoura
Quarto membro da banca
Carvalho, Otávio Valério de
Metadata
Mostrar registro completoResumo
O vírus da cinomose (Canine distemper virus, CDV) é um importante patógeno de cães e
apresenta distribuição mundial. O CDV apresenta alta variabilidade genética e várias
linhagens virais têm sido descritas, principalmente pela análise filogenética do gene da
hemaglutinina (H). A variabilidade do CDV também influencia o seu diagnóstico molecular,
sendo essencial a utilização de primers que permitam a amplificação das diferentes variantes
virais. Nesse contexto, o primeiro estudo desta tese objetivou investigar a adequação de H, e
de outros genes virais, para a classificação filogenética de CDV. Para isso, comparou-se a
classificação de 116 genomas completos (GCs) de CDV (GenBank) com aquela obtida pela
análise das sequências de nucleotídeos (nt) e aminoácidos (aa) da H, e também calculou-se a
distância geodésica entre as árvores de GC e H. Essas análises foram repetidas com os demais
genes virais e uma análise de recombinação foi realizada com as sequências de GC. As
classificações baseadas nas sequências de H apresentaram discordâncias daquelas do GC.
Além disso, fortes sinais de recombinação foram identificados no gene H. A árvore
filogenética baseada em H apresentou a quinta maior distância geodésica em relação ao GC.
Por outro lado, os genes da fosfoproteína (P) e C foram capazes de reproduzir a classificação
do GC e apresentaram a primeira e terceira menor distâncias geodésicas do GC,
respectivamente. Não foram identificados fortes sinais de recombinação em P e C. Esses
achados alertam para a classificação de CDV baseadas em H e sugerem o uso de P e C para
identificação das linhagens virais. No segundo estudo, foi desenvolvido um par de primers
para uma região interna do gene C, de alta cobertura para detecção de CDV, e passível de uso
em RT-PCR e RT-qPCR. Para tal, 194 sequências de genoma completo/quase completo de
CDV (GenBank) foram analisadas quanto à presença de regiões conservadas para a seleção de
primers capazes de gerar um amplicon de tamanho adequado para a RT-PCR e RT-qPCR. As
reações baseadas nesses primers foram otimizadas e avaliadas quanto à sensibilidade e
especificidade analítica e desempenho diagnóstico; o último analisado com 70 amostras
clínicas suspeitas de cinomose. A cobertura desses primers e seu desempenho diagnóstico
foram comparados ao par de primers PP-I, frequentemente utilizados em estudos do CDV. Os
primers forward e reverse do estudo anelaram (in silico) em 100 e 99% das sequências
analisadas, respectivamente; já os primers forward e reverse de PP-I falharam em anelar em
85% e 90% sequências, respectivamente. Os ensaios de RT-PCR e RT-qPCR com os primers
deste estudo, bem como a reação com PP-I, apresentaram limite de detecção de 0,01
TCID50/mL. As reações com os primers desse estudo também apresentaram alta
especificidade, não amplificando outros vírus importantes no diagnóstico diferencial de CDV.
Das 70 amostras clínicas utilizadas para avaliação do desempenho diagnóstico, 38 foram
positivas nas reações de RT-PCR e RT-qPCR com os primers deste estudo. Dentre 28
amostras positivas submetidas à reação com PP-I, apenas 19 amplificaram. Esses resultados
demonstram a sensibilidade e eficiência das reações com os primers descritos. Em conclusão,
os estudos desta tese contribuem para a epidemiologia e diagnóstico molecular de CDV.
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